ヒト幹細胞を用いた臨床研究のエビデンス創出から高度医療制度による実用化を目指した研究

文献情報

• 文献番号: 201206002A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: ヒト幹細胞を用いた臨床研究のエビデンス創出から高度医療制度による実用化を目指した研究
• 課題番号: H22-再生-一般-003
• 研究年度: 平成24(2012)年度
• 研究代表者(所属機関): 坪田 一男(慶應義塾大学 医学部)

研究分担者(所属機関)

• 榛村　重人(慶應義塾大学　医学部 )

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 厚生科学基盤研究分野 再生医療実用化研究
• 研究開始年度: 平成22(2010)年度
• 研究終了予定年度: 平成24(2012)年度
• 研究費: 7,000,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

角膜輪部上皮幹細胞不全症の治療法に培養上皮シート移植があるが、従来はマウス線維芽細胞株がフィーダー細胞に用いられており、またロット管理も厳密になされていなかった。本研究は、従来の培養上皮シートで必要とされていた異種細胞や羊膜を用いない、より安全な再生技術を確立することを目的とし、新規に開発した手法による培養角膜上皮シート移植の治療効果及び安全性を検討した。なお、本研究は眼科としては全国で始めてヒト幹細胞臨床研究指針の承認下（平成21年1月21日・厚生労働省発医政第0191004号）で行われた。平成24年度においては、平成22年度-平成23年度において明らかになってきたロット間のばらつきを克服するべく、KGF及びROCK阻害剤を利用した改良培養法をヒト幹細胞臨床研究に再申請するとともに、平行してCPC内でのテストラン及び各種培養条件の追加検討を行った。

研究方法

上皮シート培養はセルプロセッシングセンター（CPC）にてGMP準拠で行い、フィーダー細胞には米国から購入したGMP準拠のヒト間葉系幹細胞を、細胞基質には従来の羊膜に替えて臨床用フィブリンを、上皮の細胞源には米国アイバンクから購入した移植用ドナー角膜を用いた。安全性を確保するため、培養開始時のドナー角膜保存液、培養1週時の培養上清、及び培養終了時の培養上清を採取し、好気性菌、嫌気性菌、真菌、マイコプラズマ、HBV,HCV,HIV-1,HTLV-1,パルボウイルスB19、およびエンドトキシン濃度検査を行った。また、移植2日前に破壊検査を伴う品質試験を行い、移植前日に出荷判定を行った。品質試験の内容は、性状試験（形態：敷石状、細胞層数：重層）、定量試験(細胞密度)、確認試験、及び前述の微生物検査である。また、出荷時に残留ウシ血清アルブミン濃度を測定した。確認試験においては、角膜上皮の特異的分化マーカーであるケラチン3/12に替えて、より特異的な分化マーカーであるケラチン12及び未分化マーカーであるケラチン15を検討した。また、長期培養維持可能か、基材にフィブリンを用いずとも培養後に剥離可能か、出荷処理後に冷蔵保存可能かについても検討した。

結果と考察

KGF及びROCK阻害剤を利用した改良培養法を用いたテストランにおいては、培養3週間でK12/K15陽性の重層シートを得ることができた。また、3回行われた安全性試験においては好気性菌、嫌気性菌、真菌、マイコプラズマ、HIV,HBV,HCV,HTLV-1,ヒトパルボウイルスB19陰性であり、エンドトキシンに関しても基準値以下であった。平行して行った追加検討において、我々の培養法では3カ月間にわたり、上皮シートを免疫染色パターン及びコロニー形成率に影響を与えずに維持できることが明らかになった。これは、移植スケジュールや培養管理に柔軟性を与え、産業化を考慮する上で有用である。加えて、フィブリンを用いずとも基底層ごと上皮シートを剥離できる可能性も示された。出荷後の保存条件等については、さらなる検討が必要であると思われた。なお、この新規培地で再申請中のヒト幹臨床研究については、平成25年１月３１日に大臣意見を得た（厚生労働省医政0131第４号）。

結論

従来培養法で用いられるEGFに替えて、KGF及びROCK阻害剤を培養に用いることは移植用上皮シートの質の安定の上で有効であると思われる。

公開日・更新日

• 公開日: 2013-06-12
• 更新日: -

文献情報

• 文献番号: 201206002B
• 報告書区分: 総合
• 研究課題名: ヒト幹細胞を用いた臨床研究のエビデンス創出から高度医療制度による実用化を目指した研究
• 課題番号: H22-再生-一般-003
• 研究年度: 平成24(2012)年度
• 研究代表者(所属機関): 坪田 一男(慶應義塾大学 医学部)

研究分担者(所属機関)

• 榛村　重人(慶應義塾大学　医学部 )

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 厚生科学基盤研究分野 再生医療実用化研究
• 研究開始年度: 平成22(2010)年度
• 研究終了予定年度: 平成24(2012)年度
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

角膜輪部上皮幹細胞不全症の治療法に培養上皮シート移植があるが、従来はマウス線維芽細胞株がフィーダー細胞に用いられており、またロット管理も厳密になされていなかった。本研究は、従来の培養上皮シートで必要とされていた異種細胞や羊膜を用いない、より安全な再生技術を確立することを目的とし、新規に開発した手法による培養角膜上皮シート移植の治療効果及び安全性を検討した。なお、本研究は眼科としては全国で始めてヒト幹細胞臨床研究指針の承認下（平成21年1月21日・厚生労働省発医政第0191004号）で行われた。

研究方法

上皮シート培養はセルプロセッシングセンター（CPC）にてGMP準拠で行い、フィーダー細胞には米国から購入したGMP準拠のヒト間葉系幹細胞を、細胞基質には従来の羊膜に替えて臨床用フィブリンを、上皮の細胞源には米国アイバンクから購入した移植用ドナー角膜を用いた。安全性を確保するため、培養開始時のドナー角膜保存液、培養1週時の培養上清、及び培養終了時の培養上清を採取し、好気性菌、嫌気性菌、真菌、マイコプラズマ、HBV,HCV,HIV-1,HTLV-1,パルボウイルスB19、およびエンドトキシン濃度検査を行った。また、移植2日前に破壊検査を伴う品質試験を行い、移植前日に出荷判定を行った。品質試験の内容は、性状試験（形態：敷石状、細胞層数：重層）、定量試験(細胞密度)、確認試験（ケラチン3/12発現陽性）、及び前述の微生物検査である。また、出荷時に残留ウシ血清アルブミン濃度を測定した。移植は従来法に準じて行った。即ち、角膜上の瘢痕組織を角膜輪部より2-3ミリ外側にて切開し、引き続いて病的角結膜を完全除去し、全周の周辺結膜下を剥離してテノン嚢を除去。結膜下組織増殖抑制のためのマイトマイシンC処理後に生理食塩水でよく洗浄し、培養上皮シートを眼表面に密着させた。上皮シート周辺部は結膜で被覆し、結膜を縫合糸にて固定、上皮脱落防止目的で治療用コンタクトレンズを装用した。拒絶反応予防として副腎皮質ステロイド剤及び免疫抑制剤を局所及び全身投与し、感染症予防として抗菌剤の局所投与、上皮保護として治療用コンタクトレンズ装用を行った。主要評価項目は視力の回復、副次評価項目は角膜透明性及び角膜上皮表現型の維持とし、術前１週以内、術後1週、4週、12週、24週に視力検査、眼圧測定、細菌培養検査を、これに追加して術後2週、8週、16週にも視力検査を行った。

結果と考察

後述の改良法を含め、テストラン4例、移植用に5例培養し、うち1例で上皮発育不良のため、1例でドナー角膜保存液よりヒトパルボウイルス検出のため培養中止した。移植3例のうち2例において、移植前がそれぞれ矯正視力0.07及び矯正不能だったのに対し、移植後が矯正視力1.0及び0.3となり、視力の改善を認めた。また移植1例で移植翌日の上皮欠損を認めた。このように研究を進める中でロット間の上皮のばらつきなどの問題が明らかになり、これを解決するため最新の知見に基づいた培養法検討を行った。その結果培地添加物のうちEGFに替えてKGFを用い、ROCK阻害剤を追加することで、上皮シートの未分化及び分化マーカー発現、およびコロニー形成率が劇的に改善することを見出した。そこで新規培養法をヒト幹臨床研究として再申請し、平成25年1月31日に大臣意見を得た（厚生労働省医政0131第４号）。

結論

GMP準拠の安全な再生医療の普及を目指すうえで今後解決すべき点が明らかになった点において、本研究は意義が高かったと考えられる。

公開日・更新日

• 公開日: 2013-06-12
• 更新日: -

行政効果報告

• 文献番号: 201206002C

成果

• 専門的・学術的観点からの成果: 本研究ではドナー角膜輪部から上皮シートを培養し、角膜上皮幹細胞不全症の患者に移植した。テストラン、移植用含め9例の培養において、上皮の発育にはロット間でばらつきがあり、発育不良で移植中止も1例あった。再検討により、培地添加物にEGFに替えKGF及びROCK阻害剤を用いることで、上皮の未分化及び分化マーカー発現等が改善し、かつ長期培養維持可能（現在は１年を確認）な事を見出し、学会及び論文で発表した。この手法は大阪大学のiPSC由来角膜上皮細胞の培養にも取り入れられており、波及効果はあったといえる。
• 臨床的観点からの成果: 本研究の移植3例のうち、2例において移植前が矯正視力0.07及び矯正不能だったのに対し、移植後は矯正視力1.0及び0.3となり、視力の改善を認めた。一方、残り1例では移植翌日に上皮欠損を認めた。全例において視力改善はできなかったものの、一定の有効性はあったものと考えられる。また本研究ではGMP準拠の管理を行っており、安全性検査30例中1例においてドナー角膜保存液よりヒトパルボウイルスB19が検出され、移植中止に至った。よって、従来よりも安全性が担保された上皮を患者に移植できたと考えられる。
• ガイドライン等の開発: ガイドライン等の開発に本研究は直接関与していない。しかしながら、本研究の研究分担者であり培養責任者である榛村准教授は、PMDA科学委員会の細胞組織加工製品（再生医療製品）専門部会委員に選任されており、本研究で実際にGMP準拠の管理下で培養し、移植している経験をもとに議論を行っている。その意味においては、本研究で得られた知識・経験は、そのまま本邦の再生医療行政に活かされていると考えられる。
• その他行政的観点からの成果: 研究分担者である榛村准教授は本研究の経験を活かし、PMDA科学委員会の細胞組織加工製品専門部会委員として再生医療行政に関与している。運用コストや柔軟な対応が難しいなど、GMP準拠でSOPを用いて培養してみなければわからない点がノウハウとして蓄積されたことは大きい。またこれらのノウハウは、慶應義塾大学眼科で行っている再生医療ハイウェイ事業（iPS細胞）や、平成26年4月に保険収載後の移植用羊膜調整におけるSOPの徹底にも生かすことができ、行政による効率的な再生医療育成につながったと考えられる。
• その他のインパクト: 本研究の内容は、眼科系の国際学会(the Association for Research in Vision and Ophthalmology)、眼科系及び再生医療系の国内学会（再生医療学会、日本眼科学会、及び角膜カンファランス）、及び再生医療系の国際専門誌(Stem Cells Translational Medicine)に発表した。これにより、国内外の専門家集団に情報共有を図ることができたと考えられる。

発表件数

• 原著論文（和文）: 0件
• 原著論文（英文等）: 1件
• その他論文(和文): 0件
• その他論文(英文等): 0件
• 学会発表(国内学会): 4件
• 学会発表(国際学会等): 2件
• その他成果(特許の出願): 0件
• その他成果(特許の取得): 0件
• その他成果(施策への反映): 0件
• その他成果(普及・啓発活動): 0件

主な原著論文20編（論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限る）

• 原著論文1: Miyashita H, Yokoo S, Yoshida S, et al.; Long-term maintenance of limbal epithelial progenitor cells using rho-kinase inhibitor and keratinocyte growth factor. ; Stem Cells Translational Medicine , 2 ((10)) , 758-765 (2013); doi: 10.5966/sctm.2012-0156

公開日・更新日

• 公開日: 2015-05-27
• 更新日: 2017-06-09

収支報告書

• 文献番号: 201206002Z