タンパク質、核酸等の高分子医薬製剤の高感度安定性評価技術の確立に関する研究

文献情報

• 文献番号: 201132038A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: タンパク質、核酸等の高分子医薬製剤の高感度安定性評価技術の確立に関する研究
• 課題番号: H22-医薬・指定-020
• 研究年度: 平成23(2011)年度
• 研究代表者(所属機関): 阿曽 幸男(国立医薬品食品衛生研究所 薬品部)

研究分担者(所属機関)

• 米谷芳枝(星薬科大学 医薬品化学研究所 創剤構築研究室)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 健康安全確保総合研究 医薬品・医療機器等レギュラトリーサイエンス総合研究
• 研究開始年度: 平成22(2010)年度
• 研究終了予定年度: 平成23(2011)年度
• 研究費: 2,800,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

ヒト型抗体医薬に代表されるタンパク質や核酸などの高分子医薬は本来不安定であるため、高分子医薬を医療の現場で活用するためには一定の品質が保たれるように高度な製剤学的工夫による安定化が必要である。そのためには、製剤学的工夫による安定化効果を確認し、その最適化を行えるように、短期間で高分子医薬製剤の安定性を評価できる方法の開発が不可欠である。本研究においてはローカルな運動性の指標であるβ緩和時間の測定法を開発することを特徴とし、β緩和時間に基づいた高分子医薬製剤の安定性評価法を開発することを目的とする。また、タンパク質や核酸のローカルな分子運動性を制御することにより、高い安定性を有するタンパク質製剤および核酸医薬のリポソーム製剤の開発を目指す。

研究方法

スクロース等の6種類の添加剤として用いたβ-ガラクトシダーゼ凍結乾燥製剤を調製し、25-50℃における保存安定性を検討した。タンパク質のカルボニル炭素のNMR緩和時間を測定し、タンパク質分子のローカルな分子運動性を評価した。また、リポソームの表面水和の研究に最もよく用いられるPEG脂質で修飾したリポソームおよびそのリポプレックスの表面の水和状態を蛍光標識によるGP (generalized polarization) 測定と水の誘電緩和時間測定から検討した。

結果と考察

β-ガラクトシダーゼの失活速度は添加剤によって大きく異り、カルボニル炭素のNMR緩和時間が大きく、タンパク質の分子運動性が低いと考えられる製剤ほど失活が遅かった。凍結乾燥製剤中のβ-ガラクトシダーゼの安定性は分子運動性と関連することが示唆された。また、PEG修飾リポソームの水和状態は水の誘電緩和測定によって測定できることが明らかになった。リポプレックスの細胞内取り込みはPEG修飾リポソームの表面状態の影響を受けることが分かった。さらに、PEG修飾リポソーム表面でのPEGのマッシュルーム・ブラシ分布状態もGP測定と水の誘電緩和測定によって推定できることが示唆された。

結論

β-ガラクトシダーゼの保存安定性は構造緩和を引き起こすスケールの大きな分子運動よりも、NMR緩和時間によって表されるスケールの小さな分子運動とより密接に関連することが示された。スケールの小さな分子運動性を指標とする安定性予測の可能性が示唆された。また、PEG修飾リポソームの表面状態の違いによりリポプレックスの細胞内取り込みが影響を受けることが明らかになり、表面状態を評価する手法として、水の誘電緩和測定やGP測定が有用であることが分かった。

公開日・更新日

• 公開日: 2015-06-29
• 更新日: -

文献情報

• 文献番号: 201132038B
• 報告書区分: 総合
• 研究課題名: タンパク質、核酸等の高分子医薬製剤の高感度安定性評価技術の確立に関する研究
• 課題番号: H22-医薬・指定-020
• 研究年度: 平成23(2011)年度
• 研究代表者(所属機関): 阿曽 幸男(国立医薬品食品衛生研究所 薬品部)

研究分担者(所属機関)

• 米谷　芳枝(星薬科大学 医薬品化学研究所　創剤構築研究室)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 健康安全確保総合研究 医薬品・医療機器等レギュラトリーサイエンス総合研究
• 研究開始年度: 平成22(2010)年度
• 研究終了予定年度: 平成23(2011)年度
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

ヒト型抗体医薬に代表されるタンパク質や核酸などの高分子医薬は本来不安定であるため、高分子医薬を医療の現場で活用するためには一定の品質が保たれるように高度な製剤学的工夫による安定化が必要である。そのためには、製剤学的工夫による安定化効果を確認し、その最適化を行えるように、短期間で高分子医薬製剤の安定性を評価できる方法の開発が不可欠である。本研究においてはローカルな運動性の指標であるβ緩和時間の測定法を開発することを特徴とし、β緩和時間に基づいた高分子医薬製剤の安定性評価法を開発することを目的とする。また、タンパク質や核酸のローカルな分子運動性を制御することにより、高い安定性を有するタンパク質製剤および核酸医薬のリポソーム製剤の開発を目指す。

研究方法

モデルタンパク質としてインスリンおよびβ-ガラクトシダーゼを用い、スクロースなどの5種類の糖類を添加剤として用いた凍結乾燥製剤の保存安定性を検討した。スケールの異なる分子運動性の指標であるエンタルピー緩和時間やNMR緩和時間などを測定し、タンパク質分子の分子運動性を評価した。また、PEG脂質で修飾したリポソームおよびそのリポプレックスの表面の水和状態を蛍光標識によるGP (generalized polarization) 測定と水の誘電緩和時間測定から検討し、リポプレックスの取り込に及ぼす水和状態の影響を検討した。

結果と考察

インスリンの保存安定性は凍結乾燥する前の溶液のpHおよび、構造緩和を引き起こすスケールの大きな分子運動性の影響を受けた。一方、β-ガラクトシダーゼの凍結乾燥製剤の安定性は、NMR緩和時間で表されるスケールの小さな分子運動と密接に関連した。また、PEG修飾リポソームについて蛍光物質を用いた蛍光測定と誘電緩和時間測定から、表面をPEG脂質により修飾したリポソームは水和し、PEG脂質を用いて表面修飾したリポソームとプラスミドDNAとの複合体になると脱水和する傾向がみられた。PEGの表面水和状態がリポプレックスの細胞内取り込みに影響することが明らかとなった。さらに、PEG修飾リポソーム表面でのPEGのマッシュルーム・ブラシ分布状態もGP測定と水の誘電緩和測定によって推定できることが示唆された。

結論

分子運動性を指標としたタンパク質凍結乾燥製剤の安定性予測の可能性が示唆された。また、PEG修飾リポソームの表面状態の違いによりリポプレックスの細胞内取り込みが影響を受けることが明らかになり、表面状態を評価する手法として、水の誘電緩和測定や蛍光プローブを用いた方法が有用であることが分かった。

公開日・更新日

• 公開日: 2015-06-29
• 更新日: -

行政効果報告

• 文献番号: 201132038C

成果

• 専門的・学術的観点からの成果: タンパク質分子NMR緩和時間を運動性を指標とすることによって、凍結乾燥製剤中のタンパク質の保存安定性を予測できる可能性が示唆された。また、PEG修飾リポソームの表面状態の違いによりリポプレックスの細胞内取り込みが影響を受けることが明らかになり、表面状態を評価する手法として、水の誘電緩和測定や蛍光プローブを用いた方法が有用であることが分かった。
• 臨床的観点からの成果: 安全性に優れた遺伝子導入用リポソーム製剤の遺伝子導入効率を改善することを目的として、PEG修飾リポソームについて検討した。その結果、リポプレックスの表面の水和状態などの表面物性が遺伝子導入効率と関係している明らかにした。本研究において開発した誘電緩和測定によるリポソームの水和状態の評価法は遺伝子導入用リポソームベクターの細胞内取り込みの予測に有用であることが示唆され、臨床での応用が期待される。
• ガイドライン等の開発: なし
• その他行政的観点からの成果: なし
• その他のインパクト: なし

発表件数

• 原著論文（和文）: 0件
• 原著論文（英文等）: 5件
• その他論文(和文): 0件
• その他論文(英文等): 1件
• 学会発表(国内学会): 4件
• 学会発表(国際学会等): 2件
• その他成果(特許の出願): 0件 ; 「出願」「取得」計0件
• その他成果(特許の取得): 0件
• その他成果(施策への反映): 0件
• その他成果(普及・啓発活動): 0件

主な原著論文20編（論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限る）

• 原著論文1: Yoshie Maitani, Ayako Nakamura, Yukio Aso; Hydration of surfactant-modified and PEGylated cationic cholesterol-based liposomes and corresponding lipoplexes by monitoring a fluorescent probe and the dielectric relaxation time.; Int. J. Pharm. , 472 , 372-378 (2012)
• 原著論文2: Yoshioka S., Aso Y., Pikal M. J; Effect of Sugars on the Molecular Motion of Freeze-dried Protein Formulations Reflected by NMR Relaxation Times.; Pharm. Res. , 28 , 3237-3247 (2011)
• 原著論文3: Wang, B., Aso, Y., Pikal, M. J.; The impact of thermal treatment on the stability of freeze-driedamorphous pharmaceuticals: II. Aggregation in an IgG1 fusion protein.; J. Pharm. Sci. , 99 , 683-700 (2010)
• 原著論文4: T. Izumisawa, K. Toma, Y. Maitani,; Cell line-dependent internalization pathways determine DNA transfection efficiency of decaarginine-PEG-lipid; Int J Pharm. , 404 , 264-270 (2011)
• 原著論文5: Y. Maitani,; Lipoplex formation using liposomes prepared by ethanol injection; Methods Mol Biol. , 605 , 393-403 (2010)

公開日・更新日

• 公開日: 2015-06-29
• 更新日: 2016-06-13

収支報告書

• 文献番号: 201132038Z