文献情報
文献番号
201128097A
報告書区分
総括
研究課題名
ペリツェウス・メルツバッハー病の診断及び治療法の開発
課題番号
H22-難治・一般-137
研究年度
平成23(2011)年度
研究代表者(所属機関)
田上 昭人(独立行政法人国立成育医療研究センター研究所 薬剤治療研究部)
研究分担者(所属機関)
- 山内 淳司(独立行政法人国立成育医療研究センター研究所 薬剤治療研究部)
- 宮本 幸(独立行政法人国立成育医療研究センター研究所 薬剤治療研究部 )
- 鳥居 知宏(独立行政法人国立成育医療研究センター研究所 薬剤治療研究部 )
研究区分
厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 難治性疾患克服研究
研究開始年度
平成22(2010)年度
研究終了予定年度
平成23(2011)年度
研究費
10,000,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書(概要版)
研究目的
PMDおよびPMLDの病態分子機構の解明とそれを基盤とした治療薬開発を目的とする。
研究方法
(1) PMDを模倣するin vitro病態共培養系
神経細胞は、ラットおよびマウスの後根神経節から単離した。オリゴデンドロサイトは、胎児ラット大脳から精製した。PMDを模倣する病態共培養系は、オリゴデンドロサイト前駆細胞に、PLP1をコードするレトロウィルスを感染させた。
(2) PLP1による細胞変性度の判定
オリゴデンドロサイトと神経細胞の共培養を行ったのち、抗ミエリン塩基性蛋白質(MBP)抗体を用いて染色を行った。
(3)治療薬標的分子のスクリーニングとその候補分子の同定
病態共培養系を用いて、化合物ライブラリーをPLP1レトロウィルス感染時にオリゴデンドロサイト前駆細胞に同時に添加し分化誘導を行った。PLP1によるミエリン形成不全を改善する効果の得られた共培養に関してRNAを抽出し標的分子候補を同定した。
(4) 標的分子の機能が阻害された遺伝子改変動物の作製
髄鞘形成グリア細胞特異的に標的キナーゼを阻害するトランスジェニックマウスの作製を行った。
(5) PMLD原因遺伝子の機能解析
グリア細胞特異的なプロモーター下流に変異を有するHyccin遺伝子を挿入したベクターを作製した。
(6) PMLDを模倣する病態共培養系の構築
Hyccinによる病態共培養系を構築するための準備段階として、Hyccin蛋白質がオリゴデンドロサイトのミエリン形成に及ぼす影響について解析を行った。
神経細胞は、ラットおよびマウスの後根神経節から単離した。オリゴデンドロサイトは、胎児ラット大脳から精製した。PMDを模倣する病態共培養系は、オリゴデンドロサイト前駆細胞に、PLP1をコードするレトロウィルスを感染させた。
(2) PLP1による細胞変性度の判定
オリゴデンドロサイトと神経細胞の共培養を行ったのち、抗ミエリン塩基性蛋白質(MBP)抗体を用いて染色を行った。
(3)治療薬標的分子のスクリーニングとその候補分子の同定
病態共培養系を用いて、化合物ライブラリーをPLP1レトロウィルス感染時にオリゴデンドロサイト前駆細胞に同時に添加し分化誘導を行った。PLP1によるミエリン形成不全を改善する効果の得られた共培養に関してRNAを抽出し標的分子候補を同定した。
(4) 標的分子の機能が阻害された遺伝子改変動物の作製
髄鞘形成グリア細胞特異的に標的キナーゼを阻害するトランスジェニックマウスの作製を行った。
(5) PMLD原因遺伝子の機能解析
グリア細胞特異的なプロモーター下流に変異を有するHyccin遺伝子を挿入したベクターを作製した。
(6) PMLDを模倣する病態共培養系の構築
Hyccinによる病態共培養系を構築するための準備段階として、Hyccin蛋白質がオリゴデンドロサイトのミエリン形成に及ぼす影響について解析を行った。
結果と考察
(1) PMDによる細胞変性を改善する標的分子であるキナーゼの生体内での検証
現在までに標的分子の機能阻害型トランスジーンの作製を行った。
(2) PMLD原因遺伝子の点変異型トランスジェニックマウスの作製
トランスジーンの作製を終了し、一般的なトランスジェニックマウスの作製法に従い、マウス受精卵へのインジェクションを行った。
(3) PMLD原因遺伝子の細胞内局在の解析
Hyccin野生型および変異型の細胞内局在を観察した結果、野生型と比較し変異型Hyccinが主に小胞体に多量に蓄積していることが判明した。
現在までに標的分子の機能阻害型トランスジーンの作製を行った。
(2) PMLD原因遺伝子の点変異型トランスジェニックマウスの作製
トランスジーンの作製を終了し、一般的なトランスジェニックマウスの作製法に従い、マウス受精卵へのインジェクションを行った。
(3) PMLD原因遺伝子の細胞内局在の解析
Hyccin野生型および変異型の細胞内局在を観察した結果、野生型と比較し変異型Hyccinが主に小胞体に多量に蓄積していることが判明した。
結論
in vitro病態共培養系を独自に開発しそれを用いて同定された治療標的因子候補の薬物効果を再び試験管内で実証することに成功した。今後、この系を応用し、PMLDを含む他のミエリン形成不全疾患を改善する薬物スクリーニング系の開発を行い、脱ミエリン疾患全般の病態機構解明を行う。
公開日・更新日
公開日
2013-03-12
更新日
-