膜蛋白質発現系を利用したＣ型肝炎ウイルス感染受容体の生化学的・疫学的解析及び感染阻害剤の開発

文献情報

• 文献番号: 201125016A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: 膜蛋白質発現系を利用したＣ型肝炎ウイルス感染受容体の生化学的・疫学的解析及び感染阻害剤の開発
• 研究課題名（英字）: -
• 課題番号: H21-肝炎・若手-016
• 研究年度: 平成23(2011)年度
• 研究代表者(所属機関): 阿部 康弘(独立行政法人医薬基盤研究所 創薬基盤研究部)

研究分担者(所属機関)

• 近藤　昌夫(大阪大学大学院　薬学研究科)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 肝炎等克服緊急対策研究
• 研究開始年度: 平成21(2009)年度
• 研究終了予定年度: 平成23(2011)年度
• 研究費: 4,714,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

周知のように、C型肝炎治療の基本戦略の第一は肝細胞中のC型肝炎ウイルス（HCV）を排除すること、第二はHCVの新規感染を阻害することにある。現在までに、HCV排除活性を有するインターフェロン療法の進歩により、C型肝炎の奏効率は50%まで改善されているものの、重篤な副作用も報告されており、耐性ウイルスの出現、高ウイルス量患者には効果が乏しいことから、HCV感染阻害薬、感染受容体アンタゴニストの創出が急務となっている。しかしながら、HCV感染受容体をintactな状態で精製するのが困難なこと、抗原性が低く細胞外領域に対する抗体の作製に成功した例が少ないことから、HCV感染機構の生化学的解析は遅々として進展していない。そこで本研究は、１）出芽バキュロウイルス（BV）膜蛋白質発現系を利用した感染受容体の生化学的解析によりHCV感染機構を詳細評価し、２）独自のアンタゴニスト創出技術を活用して作製したHCV感染受容体アンタゴニストを創出することを目的とする。

研究方法

本年度は、SR-BI、CD81、claudin-1、occludinを複数同時に提示するBVの作製し、HCV感染受容体の生化学的解析に供した。また、HCV感染受容体アンタゴニストの創出を目的に、claudin提示BVを免疫したclaudin欠損マウスを用いてscFv提示ファージライブラリを作製し、claudin-1結合性scFv提示ファージのスクリーニングを行った。

結果と考察

各感染受容体提示BVについて高タイターBVを調整、共感染させることで2?4種類のHCV受容体を同時に提示したBVの作製に成功した。続いて、感染阻害活性を解析したところ、いずれのBV処理でもHCVpvの侵入促進効果が認められた。さらに、scFv提示ファージライブラリを用いてスクリーニングを行うことで、claudin-1結合性ファージクローンを単離・同定することに成功した。

結論

作製したHCV感染受容体発現BVを用いることで、HCV感染機構の解析及びHCV感染受容体に対するアンタゴニストの創製が期待される。

公開日・更新日

• 公開日: 2012-05-08
• 更新日: -

文献情報

• 文献番号: 201125016B
• 報告書区分: 総合
• 研究課題名: 膜蛋白質発現系を利用したＣ型肝炎ウイルス感染受容体の生化学的・疫学的解析及び感染阻害剤の開発
• 研究課題名（英字）: -
• 課題番号: H21-肝炎・若手-016
• 研究年度: 平成23(2011)年度
• 研究代表者(所属機関): 阿部 康弘(独立行政法人医薬基盤研究所 創薬基盤研究部)

研究分担者(所属機関)

• 近藤　昌夫(大阪大学大学院　薬学研究科)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 肝炎等克服緊急対策研究
• 研究開始年度: 平成21(2009)年度
• 研究終了予定年度: 平成23(2011)年度
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

周知のように、C型肝炎治療の基本戦略の第一は肝細胞中のC型肝炎ウイルス（HCV）を排除すること、第二はHCVの新規感染を阻害することにある。現在までに、HCV排除活性を有するインターフェロン療法の進歩により、C型肝炎の奏効率は50%まで改善されているものの、重篤な副作用も報告されており、耐性ウイルスの出現、高ウイルス量患者には効果が乏しいことから、HCV感染阻害薬、感染受容体アンタゴニストの創出が急務となっている。しかしながら、HCV感染受容体をintactな状態で精製するのが困難なこと、抗原性が低く細胞外領域に対する抗体の作製に成功した例が少ないことから、HCV感染機構の生化学的解析は遅々として進展していない。そこで本研究は、１）出芽バキュロウイルス（BV）膜蛋白質発現系を利用した感染受容体の生化学的解析によりHCV感染機構を詳細評価し、２）独自のアンタゴニスト創出技術を活用して作製したHCV感染受容体アンタゴニストを出発材料として、感染阻害薬を創出することを目的とする。

研究方法

本研究では、HCV感染受容体として同定されているSR-BI、CD81、claudin-1、occludin を単独、あるいは複数同時に提示するBVの作製し、HCV感染機構の生化学的解析に供した。さらに、感染阻害分子創製のパイロットスタデイとして、claudin欠損マウスにclaudin提示BVを抗原として免疫することで、一本鎖抗体（scFv）提示ファージライブラリを作製し、claudin-1結合性scFv提示ファージのスクリーニングを行った。

結果と考察

各種HCV感染受容体を単独、あるいは複数同時に提示したBVの作製に成功した。さらに、作製したclaudin-1提示BVを免疫抗原として用いることで、scFv提示ファージライブラリを構築し、スクリーニングの結果、claudin-1結合性ファージクローンを単離・同定することに成功した。

結論

本研究成果は、膜蛋白質発現系であるBVシステムを用いることで、未だ不明な点が多いHCV感染機構の生化学的解析を進めると同時に、BVを抗原として用いることで本解析結果をシームレスに感染アンタゴニスト創製系にのせることができる可能性を示すものである。

公開日・更新日

• 公開日: 2012-05-08
• 更新日: -

行政効果報告

• 文献番号: 201125016C

成果

• 専門的・学術的観点からの成果: 本研究で作製したHCV感染受容体発現BVは、HCV感染機構の解析ツールとして有用であるだけでなく、HCV感染受容体に対するアンタゴニストの開発ツールとしても期待される。さらに、独自のアンタゴニスト創出技術を活用して作製した HCV 感染受容体アンタゴニストを出発材料として、生体内安定性、阻害域を改変した感染阻害薬の創出に繋がることが期待される。
• 臨床的観点からの成果: HCV感染受容体アンタゴニストが開発できれば、将来的に患者のみならず医療従事者等のハイリスクグループに対して感染予防法を提供できる可能性がある。
• ガイドライン等の開発: 該当なし
• その他行政的観点からの成果: 該当なし
• その他のインパクト: 当該研究成果を社会や国民に発信するため、国内外の学会で精力的に発表・意見交換するとともに、3年間で30報の論文を公表した。

発表件数

• 原著論文（和文）: 0件
• 原著論文（英文等）: 22件
• その他論文(和文): 4件
• その他論文(英文等): 4件
• 学会発表(国内学会): 38件
• 学会発表(国際学会等): 24件
• その他成果(特許の出願): 0件 ; 「出願」「取得」計0件
• その他成果(特許の取得): 0件
• その他成果(施策への反映): 0件
• その他成果(普及・啓発活動): 0件

主な原著論文20編（論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限る）

• 原著論文1: Nomura T, Abe Y, Kamada H et al.; Novel protein engineering strategy for creating highly receptor-selective mutant TNFs; Biochem Biophys Res Commun (2009)
• 原著論文2: Kayamuro H, Abe Y, Yoshioka Y et al.; The use of a mutant TNF-alpha as a vaccine adjuvant for the induction of mucosal immune responses; Biomaterials (2009)
• 原著論文3: Matsuhisa K, Kondoh M, Takahashi A et al.; A novel tumor-targeted therapy using a claudin-4-targeting molecule.; Mol Pharmacol (2009)
• 原著論文4: Kakutani H, Kondoh M, Saeki R et al.; Claudin-4-targeting of diphtheria toxin fragment A using a C-terminal fragment of Clostridium perfringens enterotoxin.; Eur J Pharm Biopharm (2010)
• 原著論文5: Nomura T, Abe Y, Kamada H et al.; Creation of an improved mutant TNF with TNFR1-selectivity and antagonistic activity by phage display technology; Pharmazie (2010)
• 原著論文6: Shibata H, Abe Y, Yoshioka Y et al.; Generation of mouse macrophages expressing membrane-bound TNF variants with selectivity for TNFR1- or TNFR2; Cytokine (2010)
• 原著論文7: Imai S, Nagano K, Yoshida Y et al.; Development of a novel antibody proteomics system using a phage antibody library for efficient screening of tumor-related biomarker proteins; Biomaterials (2011)
• 原著論文8: Suzuki H, Kakutani H, Kondoh M et al.; The safety of a mucosal vaccine using the C-terminal fragment of Clostridium perfringens enterotoxin; Pharmazie (2010)
• 原著論文9: Itoh A, Isoda K, Kondoh M et al.; Hepatoprotective effect of syringic acid and vanillic acid on CCl₄-induced liver injury; Biol Pharm Bull (2010)
• 原著論文10: Kakutani H, Kondoh M, Fukasaka M et al.; Mucosal vaccination using claudin-4 targeting; Biomaterials (2010)
• 原著論文11: Uchida H, Kondoh M, Hanada T et al.; A claudin-4 modulator enhances the mucosal absorption of a biologically active peptide; Biochem Pharmacol (2010)
• 原著論文12: Ushitora M, Sakurai F, Yamaguchi T et al.; Prevention of hepatic ischemia-reperfusion injury by pre-administration of catalase-expressing adenovirus vector; J Control Rel (2010)
• 原著論文13: Saeki R, Kondoh M, Uchida H et al.; Potency of claudin-targeting as antitumor therapy; Mol Cell Pharmacol (2010)
• 原著論文14: Saeki R, Kondoh M, Kakutani H et al.; A claudin-targeting molecule as an inhibitor of tumor metastasis; J Pharmacol Exp Ther (2010)
• 原著論文15: Kakutani H, Takahashi A, Kondoh M et al.; A novel screening system for claudin binder using baculoviral display; PLoS ONE (2011)
• 原著論文16: Abe Y, Yoshikawa T, Inoue M et al.; Fine tuning of receptor-selectivity for tumor necrosis factor-α using a phage display system with one-step competitive panning; Biomaterials (2011)
• 原著論文17: Isoda K, Hasezaki T, Kondoh M et al.; Effect of surface charge on nano-sized silica particles-induced liver injury; Pharmazie (2011)
• 原著論文18: Hasezaki T, Isoda K, Kondoh M et al.; Hepatotoxicity of silica nanoparticles with a diameter of 100 nm; Pharmazie (2011)
• 原著論文19: Yoshida T, Kondoh M, Ojima M et al.; Adenovirus vector-mediated assay system for Hepatitis C virus replication; Nucleic Acid Res (2011)
• 原著論文20: Yoshida T, Takayama K, Kondoh M et al.; Use of human hepatocyte-like cells derived from induced pluripotent stem cells as a model for hepatocytes in hepatitis C virus infection; Biochem Biophys Res Commun (2011)

公開日・更新日

• 公開日: 2015-06-03
• 更新日: 2016-05-23

収支報告書

• 文献番号: 201125016Z
• 報告年月日: 2012年10月26日

収入

• (1)補助金交付額: 4,714,000円
• (2)補助金確定額: 4,714,000円
• 差引額 [(1)-(2)]: 0円

支出

研究費 (内訳)	直接研究費	物品費	3,364,978円
		人件費・謝金	982,885円
		旅費	333,360円
		その他	32,777円
	間接経費		0円
合計			4,714,000円

備考

• 備考: -

公開日・更新日

• 公開日: 2015-06-03
• 更新日: -