文献情報
文献番号
201124035A
報告書区分
総括
研究課題名
ＨＩＶ－１複製におけるサイクロフィリンＡの機能の解明－異性化酵素活性欠失変異体を用いた機能解析
課題番号
H23-エイズ・若手-001
研究年度
平成23(2011)年度
研究代表者(所属機関)
竹村 太地郎(国立感染症研究所エイズ研究センター)
研究分担者(所属機関)
研究区分
厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 エイズ対策研究
研究開始年度
平成23(2011)年度
研究終了予定年度
平成23(2011)年度
研究費
4,800,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
サイクロフィリンA（CypA）はHIV-1キャプシド（CA）と相互作用しHIV-1複製に関与すると考えられている宿主因子の１つであるが、その作用機序は明らかでない。本研究ではHIV-1複製におけるCypAの作用機序を解明することを目的とした。
研究方法
１ 点変異導入CypAを用いた解析
PCR法を用いて異性化酵素活性部位に変異を導入したHA標識CypA発現プラスミドを3種類（R55A、H126A、S99T）作製した。また、293T細胞に恒常発現shRNAを導入し内在CypA発現抑制細胞株（293T.CypAsh）と対照として293T.nonTshを作製した。これらの細胞株に変異CypA発現プラスミドをトランスフェクションし、２日後VSV-GでシュードタイプしたLuciferase発現HIV-1ベクターを約４時間感染させた。２日後に細胞中のLuciferase活性を計測し、それぞれの変異CypA発現細胞におけるHIV-1感染効率を評価した。
２ CypA阻害条件下においても複製可能な変異HIV-1の分離と塩基配列の解析
本研究では野生型NL4-3株とCypA結合ループに変異を導入したNL4-3(P90A.A92E)株とをCsA有無の各条件で継代培養し、CypAとCAの結合を阻害した条件下においても複製可能な変異HIV-1の分離を試みた。細胞はJurkat細胞を用い、ウイルス増殖をp24 ELISAにて評価し、ウイルス増殖の確認後、Gag領域に注目して塩基配列を決定した。
PCR法を用いて異性化酵素活性部位に変異を導入したHA標識CypA発現プラスミドを3種類（R55A、H126A、S99T）作製した。また、293T細胞に恒常発現shRNAを導入し内在CypA発現抑制細胞株（293T.CypAsh）と対照として293T.nonTshを作製した。これらの細胞株に変異CypA発現プラスミドをトランスフェクションし、２日後VSV-GでシュードタイプしたLuciferase発現HIV-1ベクターを約４時間感染させた。２日後に細胞中のLuciferase活性を計測し、それぞれの変異CypA発現細胞におけるHIV-1感染効率を評価した。
２ CypA阻害条件下においても複製可能な変異HIV-1の分離と塩基配列の解析
本研究では野生型NL4-3株とCypA結合ループに変異を導入したNL4-3(P90A.A92E)株とをCsA有無の各条件で継代培養し、CypAとCAの結合を阻害した条件下においても複製可能な変異HIV-1の分離を試みた。細胞はJurkat細胞を用い、ウイルス増殖をp24 ELISAにて評価し、ウイルス増殖の確認後、Gag領域に注目して塩基配列を決定した。
結果と考察
異性化酵素活性欠失CypA（H126A）ではHIV-1感染能が復帰しなかったことから、CypAの異性化酵素活性とそれに伴うGag蛋白質の構造変化がHIV-1複製前期過程においては必要と考えられた。また、HIV-1複製のCypA依存性がCypA結合ループとは異なるループ７領域による可能性が示され、さらにループ７領域に直接CypAが結合することが示唆された。
結論
本研究はHIV-1複製におけるCypAの機能解明を目的とした。CypAの異性化酵素活性がHIV-1複製前期過程においては必要と考えられること、HIV-1複製のCypA依存性がCypA結合ループとは異なる領域（ループ７領域）により、さらにループ７領域に直接CypAが結合する可能性が示された。
公開日・更新日
公開日
2014-05-26
更新日
-