文献情報
文献番号
199700951A
報告書区分
総括
研究課題名
胸腺内 microchimerism から見た免疫寛容誘導の研究
課題番号
-
研究年度
平成9(1997)年度
研究代表者(所属機関)
堂野 恵三(大阪大学医学部第二外科)
研究分担者(所属機関)
研究区分
厚生科学研究費補助金 先端的厚生科学研究分野 感覚器障害及び免疫・アレルギー等研究事業(免疫・アレルギー等研究分野)
研究開始年度
平成9(1997)年度
研究終了予定年度
-
研究費
2,700,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
移植医療において、移植片に対する特異的免疫寛容を誘導することが出来れば急性・慢性拒絶による移植臓器の喪失や免疫抑制剤による副作用を回避することが可能となる。ドナー抗原特異的な免疫寛容を誘導できる方法を確立することは、移植医療のさらなる発展のための最重要課題である。しかし免疫寛容の誘導に抗原の提示は必須であるが如何なる抗原を、何処にどのように提示し、また宿主の免疫系に対しどのような修飾を行えば良いのかその方法論は未だ確立されていない。
Starzlらは、肝移植後に長期生存した症例の中に、免疫抑制剤を中止しても拒絶反応が起こらず、血中・組織中に高率にドナー由来の細胞のmicrochimerismが証明される症例が存在することを報告した。この報告を契機として、多くの施設より、臓器移植後の移植片の生着とドナー由来細胞のmicrochimerismとの関連性について報告がなされた。
しかし、依然としてmicrochimerismの成立が移植片に対する免疫寛容の樹立に必須の条件なのか、移植片の長期生着の結果としてmicro-chimerismが観察されるのかは明らかではない。
一方、我々はマウスを用いた皮膚移植の系で、胸腺内にドナーの脾細胞を移入しさらに免疫抑制剤を短期間のみ使用することで、同種移植及びラットからマウスへの異種移植においても移植皮膚片の長期生着が得られることを報告している。つまり宿主の胸腺内に積極的にドナー細胞のchimerismを導入する事により移植片の生着が得られる事が明かとなった。
本研究の目的は、臓器移植後の特に胸腺内におけるmicrochimerismに着目し、その成立と免疫寛容誘導における役割の解析、およびその消失の機構解析を行うことにある。
Starzlらは、肝移植後に長期生存した症例の中に、免疫抑制剤を中止しても拒絶反応が起こらず、血中・組織中に高率にドナー由来の細胞のmicrochimerismが証明される症例が存在することを報告した。この報告を契機として、多くの施設より、臓器移植後の移植片の生着とドナー由来細胞のmicrochimerismとの関連性について報告がなされた。
しかし、依然としてmicrochimerismの成立が移植片に対する免疫寛容の樹立に必須の条件なのか、移植片の長期生着の結果としてmicro-chimerismが観察されるのかは明らかではない。
一方、我々はマウスを用いた皮膚移植の系で、胸腺内にドナーの脾細胞を移入しさらに免疫抑制剤を短期間のみ使用することで、同種移植及びラットからマウスへの異種移植においても移植皮膚片の長期生着が得られることを報告している。つまり宿主の胸腺内に積極的にドナー細胞のchimerismを導入する事により移植片の生着が得られる事が明かとなった。
本研究の目的は、臓器移植後の特に胸腺内におけるmicrochimerismに着目し、その成立と免疫寛容誘導における役割の解析、およびその消失の機構解析を行うことにある。
研究方法
体重250から300gの雄性Wistar Shionogi (WS, RT1k)ラットをrecipient、DA (RT1a) ラットをdonorとして用いた。
心移植:Ono and Lindsey の方法を用いて recipient の腹腔内に異所性に移植した。移植心の拍動が完全に停止した日を拒絶日とし、組織学的検索にて確認した。
Donor specific cell transfusion (DST):DA rats の脾細胞を5X107個尾静脈より心移植の10日前に静注し DST とした。
microchimerism の検索:胸腺・脾臓・肝臓・血液の各組織内におけるmicro-chimerism の検索は、donor RT1Bb domain 1 region sequence-specific primers を用いたRestriction fragment length polymorphism analysis 法により検索した。 各組織内のサイトカインのtranscription 半定量:胸腺・脾臓・移植片における IL-2, IFN-g, IL-4, and IL-10の transcription を移植後 3、7、21 日目にRT-PCR 法を用いて検討した。
心移植:Ono and Lindsey の方法を用いて recipient の腹腔内に異所性に移植した。移植心の拍動が完全に停止した日を拒絶日とし、組織学的検索にて確認した。
Donor specific cell transfusion (DST):DA rats の脾細胞を5X107個尾静脈より心移植の10日前に静注し DST とした。
microchimerism の検索:胸腺・脾臓・肝臓・血液の各組織内におけるmicro-chimerism の検索は、donor RT1Bb domain 1 region sequence-specific primers を用いたRestriction fragment length polymorphism analysis 法により検索した。 各組織内のサイトカインのtranscription 半定量:胸腺・脾臓・移植片における IL-2, IFN-g, IL-4, and IL-10の transcription を移植後 3、7、21 日目にRT-PCR 法を用いて検討した。
結果と考察
1)ラット心移植片の拒絶とレシピエント胸腺内におけるドナー由来細胞のmicrochimerismの関連性
DA から WS に心移植を行い、移植後3、7、21日目に胸腺・脾臓・肝臓・血液の各組織内におけるmicrochimerism を検索した。移植片の拒絶に先立ち脾臓・肝臓および一部の動物では胸腺内にmicrochimerismを認めた。脾臓および肝臓内のmicrochimerismは移植片の拒絶に関わらず21日目まで認められたが、胸腺内のmicrochimerismは7日目に消失し、拒絶後の21日目に再出現していた。心移植の10日前に DST を施行した群では、心移植の直前に胸腺・脾臓・肝臓・血液のすべてにmicrochimerismが確立されるが、拒絶の直前には同様に胸腺内のmicrochimerism のみが消失する現象が認められた。拒絶後の21日目には胸腺内に再度microchimerismが検出された。
レシピエントに免疫抑制剤として FK506 を3週間0.5mg/kg 隔日に皮下注することにより心移植片の生着日数は平均60日に延長させる事ができた。FK処置群の胸腺内のmicrochimerismを経時的に検索したところ、拒絶反応が認められない40日目まではmicrochimerismが成立していたが、拒絶反応の進行とともに胸腺内microchimerismの消失が心移植片の拒絶反応に先立ち観察された。さらに、拒絶反応が終息した70日目にはmicrochimerismが再度観察された。 FK506 を60日間0.5mg/kg 隔日に皮下注した群では移植後60日目でも胸腺内microchimerismが検出されたので、拒絶反応と胸腺内microchimerismとの間に密接な関連性があることが示唆された。)
移植片の拒絶に先立つ胸腺内におけるmicrochimerismの消失の機構解析
胸腺内microchimerismの消失機構を解析するため、ラットの同種心移植の系をもちいて、移植片の拒絶の前後における各組織内の cytokine profile について検討した。
アロ心移植後の胸腺及び脾臓内のIL-2、INF-γ、IL-4、IL-10を検討したところ、胸腺内におけるTh1 cytokine であるIL-2, INF-γm-RNA の発現量が脾臓に比して有意に高かった。また、donor specific pCTL 頻度は移植後7日目で脾臓に比して胸腺内で優位に高かった。
以上の所見より、拒絶に先立つ胸腺内microchimerismの消失は Th1 cytokine up-regulation と pCTL 頻度の上昇を伴う免疫反応によることが示唆された。
3)胸腺全摘の移植片生着に対する影響DAからWSへのラット同種同所肝移植の生着日数は免疫抑制なしでも平均68.0±16.0日であり、中等度の生着延長が認められた。この系でレシピエントの胸腺内microchimerismを検索したところ移植後7日目には全例microchimerismが成立していた。 移植前日または移植後3日目にレシピエントの胸腺を全摘すると平均生着日数はそれぞれ22.5±6.8、33.7±9.6日と対照群に比して短縮する傾向が認められた。すなわち、この系での移植肝の生着には胸腺の存在が重要な役割を演じていることが示唆された。
臨床肝移植の長期生着例ではしばしば免疫抑制剤の中止後も拒絶反応が起こらず移植肝の生着が損なわれない症例が存在する。この様な患者の血液・皮膚など移植臓器以外の部位でドナー由来細胞の micorochimerism が検出されることが報告されている。Starzl らはこれらの事実よりmicrochimerismの成立が移植片の長期生着・免疫寛容の誘導に重要な役割を演じていると考え、肝移植時のドナー骨髄細胞の同時移植等積極的にmicro-chimerismの導入を計る試みを行った。
しかし、移植片が拒絶された後にも他の組織中にmicrochimerismが検出されるため、ドナー由来細胞のmicrochimerismの存在が必ずしも移植片の受容を意味するものではないとの報告も散見される。
一方、動物実験モデルでは胸腺内にドナー抗原を投与することにより移植片の長期生着が誘導されることが示されている。そこで、今回我々は臓器移植のmicrochimerismの成立と移植片の生着・拒絶について、特に胸腺内に注目して解析を行った。
ラット心移植の系では、移植後胸腺内においてのみ移植片の拒絶前にドナー由来細胞のmicrochimerism の消失が観察された。胸腺外組織である血液・脾臓・肝臓におけるmicrochimerismの消長と拒絶反応との関連性は認められなかった。
つまり、胸腺以外の組織におけるドナー細胞のmicrochimerismは移植片の拒絶前後で継続的に検出されており、移植片の生着に寄与しているとは考えにくい。
一方、同じラットの組み合わせで肝移植を行うと、移植後早期に胸腺内にドナー細胞のmicrochimerismが確立されるが、予め胸腺を摘出すると約60日の生着期間が短縮することが観察された。
以上の知見より、移植片の生着と胸腺内の microchimerism との間には密接な関連があるものと推察される。
次に、胸腺内でのドナー細胞のmicrochimerismの消失機構を解析したところ、microchimerismの消失時期に一致して、Th1 type のcytokineのm-RNAの発現が胸腺内で亢進しており、またドナー特異的なpCTLの頻度が増加していることより、microchimerismの消失は胸腺内でのドナー抗原に対する免疫応答が寄与しているものと考えられた。
DA から WS に心移植を行い、移植後3、7、21日目に胸腺・脾臓・肝臓・血液の各組織内におけるmicrochimerism を検索した。移植片の拒絶に先立ち脾臓・肝臓および一部の動物では胸腺内にmicrochimerismを認めた。脾臓および肝臓内のmicrochimerismは移植片の拒絶に関わらず21日目まで認められたが、胸腺内のmicrochimerismは7日目に消失し、拒絶後の21日目に再出現していた。心移植の10日前に DST を施行した群では、心移植の直前に胸腺・脾臓・肝臓・血液のすべてにmicrochimerismが確立されるが、拒絶の直前には同様に胸腺内のmicrochimerism のみが消失する現象が認められた。拒絶後の21日目には胸腺内に再度microchimerismが検出された。
レシピエントに免疫抑制剤として FK506 を3週間0.5mg/kg 隔日に皮下注することにより心移植片の生着日数は平均60日に延長させる事ができた。FK処置群の胸腺内のmicrochimerismを経時的に検索したところ、拒絶反応が認められない40日目まではmicrochimerismが成立していたが、拒絶反応の進行とともに胸腺内microchimerismの消失が心移植片の拒絶反応に先立ち観察された。さらに、拒絶反応が終息した70日目にはmicrochimerismが再度観察された。 FK506 を60日間0.5mg/kg 隔日に皮下注した群では移植後60日目でも胸腺内microchimerismが検出されたので、拒絶反応と胸腺内microchimerismとの間に密接な関連性があることが示唆された。)
移植片の拒絶に先立つ胸腺内におけるmicrochimerismの消失の機構解析
胸腺内microchimerismの消失機構を解析するため、ラットの同種心移植の系をもちいて、移植片の拒絶の前後における各組織内の cytokine profile について検討した。
アロ心移植後の胸腺及び脾臓内のIL-2、INF-γ、IL-4、IL-10を検討したところ、胸腺内におけるTh1 cytokine であるIL-2, INF-γm-RNA の発現量が脾臓に比して有意に高かった。また、donor specific pCTL 頻度は移植後7日目で脾臓に比して胸腺内で優位に高かった。
以上の所見より、拒絶に先立つ胸腺内microchimerismの消失は Th1 cytokine up-regulation と pCTL 頻度の上昇を伴う免疫反応によることが示唆された。
3)胸腺全摘の移植片生着に対する影響DAからWSへのラット同種同所肝移植の生着日数は免疫抑制なしでも平均68.0±16.0日であり、中等度の生着延長が認められた。この系でレシピエントの胸腺内microchimerismを検索したところ移植後7日目には全例microchimerismが成立していた。 移植前日または移植後3日目にレシピエントの胸腺を全摘すると平均生着日数はそれぞれ22.5±6.8、33.7±9.6日と対照群に比して短縮する傾向が認められた。すなわち、この系での移植肝の生着には胸腺の存在が重要な役割を演じていることが示唆された。
臨床肝移植の長期生着例ではしばしば免疫抑制剤の中止後も拒絶反応が起こらず移植肝の生着が損なわれない症例が存在する。この様な患者の血液・皮膚など移植臓器以外の部位でドナー由来細胞の micorochimerism が検出されることが報告されている。Starzl らはこれらの事実よりmicrochimerismの成立が移植片の長期生着・免疫寛容の誘導に重要な役割を演じていると考え、肝移植時のドナー骨髄細胞の同時移植等積極的にmicro-chimerismの導入を計る試みを行った。
しかし、移植片が拒絶された後にも他の組織中にmicrochimerismが検出されるため、ドナー由来細胞のmicrochimerismの存在が必ずしも移植片の受容を意味するものではないとの報告も散見される。
一方、動物実験モデルでは胸腺内にドナー抗原を投与することにより移植片の長期生着が誘導されることが示されている。そこで、今回我々は臓器移植のmicrochimerismの成立と移植片の生着・拒絶について、特に胸腺内に注目して解析を行った。
ラット心移植の系では、移植後胸腺内においてのみ移植片の拒絶前にドナー由来細胞のmicrochimerism の消失が観察された。胸腺外組織である血液・脾臓・肝臓におけるmicrochimerismの消長と拒絶反応との関連性は認められなかった。
つまり、胸腺以外の組織におけるドナー細胞のmicrochimerismは移植片の拒絶前後で継続的に検出されており、移植片の生着に寄与しているとは考えにくい。
一方、同じラットの組み合わせで肝移植を行うと、移植後早期に胸腺内にドナー細胞のmicrochimerismが確立されるが、予め胸腺を摘出すると約60日の生着期間が短縮することが観察された。
以上の知見より、移植片の生着と胸腺内の microchimerism との間には密接な関連があるものと推察される。
次に、胸腺内でのドナー細胞のmicrochimerismの消失機構を解析したところ、microchimerismの消失時期に一致して、Th1 type のcytokineのm-RNAの発現が胸腺内で亢進しており、またドナー特異的なpCTLの頻度が増加していることより、microchimerismの消失は胸腺内でのドナー抗原に対する免疫応答が寄与しているものと考えられた。
結論
移植臓器の生着および拒絶反応に胸腺内のmicrochimerismの存在が重要な役割を演じていると考えられた。
公開日・更新日
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