文献情報
文献番号
199700901A
報告書区分
総括
研究課題名
HIV感染症に関する基礎研究(TBP-1結合蛋白質のHIV-Tat活性に及ぼす影響に関する研究)
課題番号
-
研究年度
平成9(1997)年度
研究代表者(所属機関)
佐藤 真(大阪市立大学)
研究分担者(所属機関)
研究区分
厚生科学研究費補助金 先端的厚生科学研究分野 エイズ対策研究事業
研究開始年度
平成9(1997)年度
研究終了予定年度
-
研究費
2,000,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
Human immunodeficiency virus type1(HIV-1)の制御遺伝子であるtat および rev は、ウイルス増殖に必須であることが知られている。このうち、tatによりコードされるTat蛋白質は、宿主細胞にて発現し、HIVの増殖に必須の因子と考えられている。故に、HIVの増殖のコントロールにはこのTatの働きを押さえることが重要と考えられる。
Tat結合蛋白質-1( Tat binding protein 1, TBP-1 ) は、Tat蛋白質と連関する宿主細胞側因子の一つとして報告されたもので 、現在までのところ、in vitroにてTat蛋白質のウィルスRNA転写活性化に対して抑制的に働くことが示されている。我々はTBP-1のマウスホモログをクローニングし、その組織特異的・細胞特異的発現を明らかとし、さらにCATアッセイを用い、このTBP-1マウスホモログがウイルスRNA転写活性化に対して抑制的に働くことを再確認した。一方、TBP-1は、いわゆる細胞内蛋白質分解系の中心である26S proteasomeの構成サブユニットの一つであると現在考えられている。この事実は、TBP-1がin vivoでは多くの因子と連関し作用している可能性、もしくは多くの因子がTBP-1の活性発現に影響を及ぼす可能性を示唆している。この点を鑑み、我々はTBP-1連関因子の検索を行い、TBP-1の働きに及ぼす作用について検討した。
Tat結合蛋白質-1( Tat binding protein 1, TBP-1 ) は、Tat蛋白質と連関する宿主細胞側因子の一つとして報告されたもので 、現在までのところ、in vitroにてTat蛋白質のウィルスRNA転写活性化に対して抑制的に働くことが示されている。我々はTBP-1のマウスホモログをクローニングし、その組織特異的・細胞特異的発現を明らかとし、さらにCATアッセイを用い、このTBP-1マウスホモログがウイルスRNA転写活性化に対して抑制的に働くことを再確認した。一方、TBP-1は、いわゆる細胞内蛋白質分解系の中心である26S proteasomeの構成サブユニットの一つであると現在考えられている。この事実は、TBP-1がin vivoでは多くの因子と連関し作用している可能性、もしくは多くの因子がTBP-1の活性発現に影響を及ぼす可能性を示唆している。この点を鑑み、我々はTBP-1連関因子の検索を行い、TBP-1の働きに及ぼす作用について検討した。
研究方法
実験動物として成熟ICR系マウス (10週齢、雄) を用いた(ケアリー社より購入)。実験に際しては、ぺントバルビタール (50mg/kg 体重)を腹腔内注射し麻酔後処置を行なった。
TBP-1結合因子の検索にはTwo-hybrid法を用いた。Two-hybrid システム用発現ベクター(GAL4 DNA binding domain pGBT9, GAL4 DNA activation domain pGAD10 mouse testis cDNA library ) 及び指示酵母細胞Y190はMATCHMAKER Two-Hybrid System (clontech 社)に従い、扱った。教室にてすでに得られていたmouse TBP-1 in-frame cDNA をpGBT9にGAL4 DNA 結合ドメインと融合させて組み込んだ。スクリーニングに用いたcDNAライブラリー量は1回につき約100μgで、計480μg(約480万クローンに相当) をスクリーニングした。スクリーニングの結果、陽性クローンを2つ同定し、遺伝子を回収した。この内の一つにつき塩基配列を決定、新規因子であることを確認し、この遺伝子をTBP-1結合蛋白質連関蛋白質(TBP-1 interacting protein, TBPIP)と命名し、以後検討を加えた。
ノーザンブロット解析及びin situ ハイブリダイゼーション組織化学法には成熟ICRマウス(10週齢)の精巣組織を用い、定法に従い行った。
CATアッセイはマウスTBP-1とTBPIPのcDNAを発現ベクター(pCI)に組み込んだpCI-mTBP1, pCI-TBPIP、Tat発現ベクター(pCV1-Tat)及びレポータープラスミドpBennCATをCHO細胞にtransfectionし、48時間後CAT活性をQuan-T-CATアッセイシステム(Amersham)にて測定し行った。
ヒトホモログの取得は乳癌由来のセルラインであるBT474に対し、TBPIPの両端を含む縮退プライマーを用い、PCRを行い、得られたクローンをヒトホモログとした。又、同様の方法によりヒト精巣の組織よりヒトTBP-1を得た。
Deletion mutantの作製は得られたcDNAを元に、プライマーを合成しTBP-1とTBPIPのdeletion mutantを作製し、それぞれ、pGBT9ベクターとpGAD-GHベクターに組みこむことで作製した。
TBP-1結合因子の検索にはTwo-hybrid法を用いた。Two-hybrid システム用発現ベクター(GAL4 DNA binding domain pGBT9, GAL4 DNA activation domain pGAD10 mouse testis cDNA library ) 及び指示酵母細胞Y190はMATCHMAKER Two-Hybrid System (clontech 社)に従い、扱った。教室にてすでに得られていたmouse TBP-1 in-frame cDNA をpGBT9にGAL4 DNA 結合ドメインと融合させて組み込んだ。スクリーニングに用いたcDNAライブラリー量は1回につき約100μgで、計480μg(約480万クローンに相当) をスクリーニングした。スクリーニングの結果、陽性クローンを2つ同定し、遺伝子を回収した。この内の一つにつき塩基配列を決定、新規因子であることを確認し、この遺伝子をTBP-1結合蛋白質連関蛋白質(TBP-1 interacting protein, TBPIP)と命名し、以後検討を加えた。
ノーザンブロット解析及びin situ ハイブリダイゼーション組織化学法には成熟ICRマウス(10週齢)の精巣組織を用い、定法に従い行った。
CATアッセイはマウスTBP-1とTBPIPのcDNAを発現ベクター(pCI)に組み込んだpCI-mTBP1, pCI-TBPIP、Tat発現ベクター(pCV1-Tat)及びレポータープラスミドpBennCATをCHO細胞にtransfectionし、48時間後CAT活性をQuan-T-CATアッセイシステム(Amersham)にて測定し行った。
ヒトホモログの取得は乳癌由来のセルラインであるBT474に対し、TBPIPの両端を含む縮退プライマーを用い、PCRを行い、得られたクローンをヒトホモログとした。又、同様の方法によりヒト精巣の組織よりヒトTBP-1を得た。
Deletion mutantの作製は得られたcDNAを元に、プライマーを合成しTBP-1とTBPIPのdeletion mutantを作製し、それぞれ、pGBT9ベクターとpGAD-GHベクターに組みこむことで作製した。
結果と考察
Yeast two hybrid法により取得したDNAは長さが874bpであり、Northern blot解析の結果(後述)とあわせ、ほぼ全長のcDNAに相当するものと考えられた(DNAデータバンク登録番号AB00021)。核酸の一次構造より推定される蛋白質はアミノ酸214残基よりなるものと考えられた。既知のアミノ酸との比較では、ヒト乳癌細胞よりクローニングされたGT198と対応する部分では80%強の相同性を示したが、その後の検討によりGT198はTBPIPのヒトホモログではないと考えられた(後述)。
ノーザンブロット解析の結果、精巣において約0.9Kbの位置にバンドを認めた。
in situ ハイブリダイゼーション組織化学法の結果では、精巣内では精細管内に強発現を認め、TBP-1の発現が知られているspermatogonium, spermatocyteの殆ど全てに陽性シグナルが観察された。この事実はTBPIPとTBP-1が同一細胞で共存している可能性を示唆していた。なお、血球系でのTBPIPの発現は現在検討中である。
CATアッセイの結果は以下の通りであった。
(a) TBP-1単独でもTatの転写活性化に対する抑制効果は観察された。
(b) TBPIP単独では、Tatの転写活性化に対する明瞭な抑制効果は観察されなかった。
(c) TBP-1とTBPIPではTatの転写活性化に対する抑制効果がTBP-1単独の場合に較べ増強している様子が観察された。さらに、この効果はTBPIPの量を増加させると強まった。
以上の事実はTBPIPがTBP-1に結合し、TBP-1のTatにたいする抑制的作用を増強する分子であることを示唆した。
TBPIPのヒトホモログの取得に関しては以下の結果を得た。すなわち、BT474セルラインより得られたヒトクローンは、マウスTBPIPとアミノ酸レベルで約90%(89.6%)の相同性を示し、得られたクローンがTBPIPのヒトホモログである可能性は高いものと考えられた。一方、GT198遺伝子はマウスTBPIPとの相同性は比較的高いものの(アミノ酸レベルで約80%)、そのシークエンスのC末端においてアミノ酸が連続して異なりTBPIPのヒトホモログである可能性は低いものと考えられた。
Deletion mutantの作製に関しては現在deletion mutantをTBP-1、TBPIPについてそれぞれ5種類作製した段階であり、これらは今後のTBP-1、TBPIP間の分子結合部位の同定に有用であることが期待される。
ノーザンブロット解析の結果、精巣において約0.9Kbの位置にバンドを認めた。
in situ ハイブリダイゼーション組織化学法の結果では、精巣内では精細管内に強発現を認め、TBP-1の発現が知られているspermatogonium, spermatocyteの殆ど全てに陽性シグナルが観察された。この事実はTBPIPとTBP-1が同一細胞で共存している可能性を示唆していた。なお、血球系でのTBPIPの発現は現在検討中である。
CATアッセイの結果は以下の通りであった。
(a) TBP-1単独でもTatの転写活性化に対する抑制効果は観察された。
(b) TBPIP単独では、Tatの転写活性化に対する明瞭な抑制効果は観察されなかった。
(c) TBP-1とTBPIPではTatの転写活性化に対する抑制効果がTBP-1単独の場合に較べ増強している様子が観察された。さらに、この効果はTBPIPの量を増加させると強まった。
以上の事実はTBPIPがTBP-1に結合し、TBP-1のTatにたいする抑制的作用を増強する分子であることを示唆した。
TBPIPのヒトホモログの取得に関しては以下の結果を得た。すなわち、BT474セルラインより得られたヒトクローンは、マウスTBPIPとアミノ酸レベルで約90%(89.6%)の相同性を示し、得られたクローンがTBPIPのヒトホモログである可能性は高いものと考えられた。一方、GT198遺伝子はマウスTBPIPとの相同性は比較的高いものの(アミノ酸レベルで約80%)、そのシークエンスのC末端においてアミノ酸が連続して異なりTBPIPのヒトホモログである可能性は低いものと考えられた。
Deletion mutantの作製に関しては現在deletion mutantをTBP-1、TBPIPについてそれぞれ5種類作製した段階であり、これらは今後のTBP-1、TBPIP間の分子結合部位の同定に有用であることが期待される。
結論
(1) マウスにおいてTat結合蛋白質-1 (Tat binding protein -1, TBP-1)に結合しうる新規因子(TBP-1連関因子、TBP-1 interacting protein, TBPIP)をクローニングした。
(2) CATアッセイの結果、TBPIPにはTBP-1のTatに対する作用を増強する、すなわちTBP-1のTatを介したHIV転写活性抑制作用を増強する働きが確認された。
(3) TBPIPのヒトホモログをクローニングした。
(4) TBP-1とTBPIPの結合を分子レベルで解析するため、それぞれ5種類のdeletion mutantベクターを作製した。
(2) CATアッセイの結果、TBPIPにはTBP-1のTatに対する作用を増強する、すなわちTBP-1のTatを介したHIV転写活性抑制作用を増強する働きが確認された。
(3) TBPIPのヒトホモログをクローニングした。
(4) TBP-1とTBPIPの結合を分子レベルで解析するため、それぞれ5種類のdeletion mutantベクターを作製した。
公開日・更新日
公開日
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