輸血副作用の原因遺伝子ハプトグロビン欠失アリルの迅速簡便な診断法の確立と輸血前診断への臨床応用

文献情報

文献番号
201034005A
報告書区分
総括
研究課題名
輸血副作用の原因遺伝子ハプトグロビン欠失アリルの迅速簡便な診断法の確立と輸血前診断への臨床応用
課題番号
H20-医薬・一般-008
研究年度
平成22(2010)年度
研究代表者(所属機関)
神田　芳郎(久留米大学　医学部)
研究分担者(所属機関)
  • 佐川　公矯(久留米大学　医学部 )
研究区分
厚生労働科学研究費補助金 健康安全確保総合研究分野 医薬品・医療機器等レギュラトリーサイエンス総合研究
研究開始年度
平成20(2008)年度
研究終了予定年度
平成22(2010)年度
研究費
3,500,000円
研究者交替、所属機関変更
-

研究報告書（概要版）

研究目的
輸血後アナフィラキシーショックの原因となり得る血漿蛋白欠損のうち日本人を含む東アジア人集団では、ハプトグロビン（Hp）欠損症が最も高頻度である。Hp遺伝子の全長欠失を伴うHp遺伝子欠失アリル（Hpdel）は先天性Hp欠損症の原因遺伝子で、ホモ接合体ではHpが合成されず、輸血等により抗Hp抗体が産生されアナフィラキシーショックを惹起すると考えられる。日本赤十字社による調査では無Hp血症患者は全例Hpdelのホモ接合体であり、輸血前にHpdelの遺伝子検査を実施すれば、無Hp血症に基く重篤な輸血副作用の回避が可能になると考えられる。当該研究計画の目的は、臨床現場で利用可能なHpdel迅速診断法を確立し、より安全な輸血医療の実現を目指すことである。
研究方法
当該年度では、より広い臨床現場における検査の実現を目的とし、専用機器や遺伝子解析専門技術者を必要としない恒温DNA増幅法であるLAMP（Loop-mediated isothermal amplification）法を用いたHpdel検出法を確立した。さらにこれまでに開発した２つのリアルタイムPCR法を用いて、新規に導入したリアルタイムPCR機器（LightCycler 480）を用い、機器間での結果の相同性あるいはソフトウェアの使い勝手等の比較をおこなった。また、リアルタイムPCR法の汎用化に伴い、特徴の異なる反応試薬製品が購入可能となっており、こうした製品を用い既に確立した診断法2法についての最適化と評価をおこなった。
結果と考察
当該年度では輸血前診断を継続し研究期間終了の平成23年3月31日までに5,286名の輸血予定患者について遺伝子診断を実施し、2名のHpdelホモ接合体と180名のヘテロ接合体を認めた。また、さらに広い施設でのHpdel診断を可能にするために、LAMP法による診断法を確立した。鋳型となる血液サンプルの調整法を幾つか比較し、従来この方法で用いられてきた熱変性と遠心を必要としない50 mM NaOHによる希釈のみで検査が可能となり熱変性をおこなう為のブロックインキュベーターや遠心機が不要で必要な機器が恒温槽のみになったことで目的に即した検査法が確立できた。また、他予算により導入されたリアルタイムPCR機器を用いた使用機器の比較、市販の反応試薬を用いた試薬の比較を通じ、更なる診断法の簡便化と最適化を達成することができた。
結論
当該研究期間内に開発をおこなった3つの診断法によって得られた遺伝子型はこれまでに調べた全てのサンプルで一致し、いずれの診断法も信頼に耐えうる方法であることを示すことができた。

公開日・更新日

公開日
2011-05-23
更新日
-

文献情報

文献番号
201034005B
報告書区分
総合
研究課題名
輸血副作用の原因遺伝子ハプトグロビン欠失アリルの迅速簡便な診断法の確立と輸血前診断への臨床応用
課題番号
H20-医薬・一般-008
研究年度
平成22(2010)年度
研究代表者(所属機関)
神田　芳郎(久留米大学　医学部)
研究分担者(所属機関)
  • 佐川　公矯(久留米大学　医学部 )
研究区分
厚生労働科学研究費補助金 健康安全確保総合研究分野 医薬品・医療機器等レギュラトリーサイエンス総合研究
研究開始年度
平成20(2008)年度
研究終了予定年度
平成22(2010)年度
研究者交替、所属機関変更
-

研究報告書（概要版）

研究目的
輸血後アナフィラキシーショックの原因となり得る血漿蛋白欠損のうち日本人を含む東アジア人集団では、ハプトグロビン（Hp）欠損症が最も高頻度であることが知られている。Hp遺伝子の全長欠失を伴うHp遺伝子欠失アリル（Hpdel）は先天性Hp欠損症の原因遺伝子で、ホモ接合体ではHpが合成されず、輸血等により抗Hp抗体が産生されアナフィラキシーショックを惹起すると考えられる。輸血前にHpdelの遺伝子検査を実施すれば、無Hp血症に基く重篤な輸血副作用の回避が可能になると考えられる。当該研究計画の目的は、臨床現場で利用可能なHpdel迅速診断法を確立し、より安全な輸血医療の実現を目指すことにある。
研究方法
リアルタイムPCR法やLAMP（Loop-mediated isothermal amplification）法を用いたHpdel検出法の確立し、臨床応用を目的とした輸血前患者血液の検査を実施し、リアルタイムPCR法の最適化をおこなった。
結果と考察
平成20年度にTaqManプローブを用いたHpdelの接合性を判定するリアルタイムPCR法を確立し、さらにハプトグロビンの主要な遺伝子型Hp1, Hp2の判定とHpdelの検出を同時におこなうトリプレックスPCR法を確立し、多数検体のHpdelを含むハプトグロビン遺伝子型の判定による詳細な遺伝子頻度の決定を可能にした。また平成21年1月から輸血前患者に対する遺伝子診断を開始し、平成23年3月までに5286名の診断を行い、2名のHpdelホモ接合体と180名のヘテロ接合体を認めた。平成21年度には、DNAインターカレーターであるSYBR Green Iを用い増幅反応後に融解曲線解析を実施しTm値を評価することにより1本のチューブでHpdelの接合性を判定可能なリアルタイムPCR法を確立した。平成22年度には、専用機器や遺伝子解析専門技術者を必要としない恒温DNA増幅法であるLAMP法を用いたHpdel検出法を確立し、さらに、新規に導入したリアルタイムPCR機器を用い、機器間での結果の相同性あるいはソフトウェアの使い勝手等の比較をおこない、最適な試薬と機器の組み合わせを見出すことができた。
結論
本研究計画期間中に、リアルタイムPCR法による2つの診断法、LAMP反応による診断法を確立した。これら3つの方法を比較検討した結果、いずれの方法も特異性、感受性共に100％で、簡便、安価であり、採血から約1時間半で診断可能である。輸血前診断を通して、希釈血液を直接鋳型とすることができ、さらに最適化されたことからさまざまな臨床現場への導入が可能である。

公開日・更新日

公開日
2011-05-23
更新日
-

行政効果報告

文献番号
201034005C

成果

専門的・学術的観点からの成果
リアルタイムPCR法による2つのハプトグロビン欠失アリル診断法およびLAMP反応による診断法を確立したが、いずれの方法もゲノムDNAを抽出することなく希釈血液を直接鋳型として用いることが可能である。さらにこれらのうちTaqManプローブを用いる方法を応用し、ハプトグロビンの遺伝子型を判定できるリアルタイムPCR法も開発し、臨床試料に応用可能であることを示した。これらの成果はいずれも国内外の輸血および臨床検査関連の査読のある専門誌に掲載された。
臨床的観点からの成果
本研究計画期間中に、我々はリアルタイムPCR法による2つのハプトグロビン欠失アリル診断法に加え、LAMP反応による診断法を確立し、3つの方法を比較検討した。これらの方法は、その特徴から、検体数や施設の環境応じて選択可能であり、いずれの方法も簡便、安価であり、これまで約5時間を要した遺伝子検査が、これらの方法を用いることにより、採血から約1時間半で診断でき患者並びに検査担当者の負担が少なく、さまざまな臨床現場で利用可能で非常に有効な診断法であると考えられる。
ガイドライン等の開発
リアルタイムPCR法による2つの診断法およびLAMP反応による診断法に関してはいずれも査読のある国内外の専門誌に投稿し掲載されており、すべての研究者がこれらの方法を用いてハプトグロビン欠失アリル遺伝子診断を行うことが可能である。また久留米大学医学法医学・人類遺伝学講座ホームページに相談窓口を設けている。これらの方法は簡便でありまた特異性、感受性も我々の施設では100％であり有用な検査法であると判断されるが、ガイドラインは開発していない。
その他行政的観点からの成果
ハプトグロビン欠損症は2005年から各種血液製剤添付資料「慎重投与の項」に記載されるようになってきた。現在先天性ハプトグロビン欠損症の原因変異として唯一同定されている遺伝子変異がハプトグロビン欠失アリルであり、その輸血前診断は有用であると考えられ、また非常に安価な検査法でもあるが、審議会等で参考にされたり、行政施策に反映され手はおらず、現状では行政的観点からみて大きな成果が得られたとは言い難い状態である。
その他のインパクト
我々が開発した2種類のリアルタイムPCR法およびLAMP法はいずれも希釈血液を直接鋳型として用いることが可能であり、このような簡便な鋳型調整法はハプトグロビン遺伝子欠失の遺伝子診断以外にも応用可能であると考えられ、実際ハプトグロビン遺伝子多型研究者以外にも、ウイルスや細菌学の分野で診断を行っている研究者等から、我々の論文に対して文献の別刷り請求が届いている。また年2回開催されている輸血関連研究班合同班会議で計4回の発表を行った。

発表件数

原著論文（和文）
1件
原著論文（英文等）
4件
その他論文(和文)
0件
その他論文(英文等)
0件
学会発表(国内学会)
6件
学会発表(国際学会等)
1件
その他成果(特許の出願)
0件
「出願」「取得」計0件
その他成果(特許の取得)
0件
その他成果(施策への反映)
0件
その他成果(普及・啓発活動)
0件

特許

主な原著論文20編（論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限る）

論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限ります。

原著論文1
Soejima M, Koda Y.
TaqMan-based real-time PCR for genotyping common polymorphisms of haptoglobin (HP1 and HP2).
Clin Chem , 54 (11) , 1908-1913  (2008)
原著論文2
Nakamura H, Soejima M, Munkhtulga L, et al.
Haptoglobin polymorphism in Mongolian population: comparison of the two genotyping methods.
Clin Chim Acta , 408 (1) , 110-113  (2009)
原著論文3
Soejima M, Tsuchiya Y, Egashira K, et al.
Development and validation of a SYBR Green I-based real-time polymerase chain reaction method for detection of haptoglobin gene deletion in clinical materials.
Transfusion , 50 (6) , 1322-1327  (2010)
原著論文4
Soejima M, Egashira K, Kawano H, et al.
Rapid Detection of Haptoglobin-Gene Deletion in Alkaline-Denatured Blood by Loop-Mediated Isothermal Amplification Reaction.
J Mol Diagn , 13 (3) , 334-339  (2011)
原著論文5
神田芳郎、副島美貴子、川野洋之 他
輸血副作用原因遺伝子ハプトグロビン欠失アリルの輸血前診断法の検討
日本輸血細胞治療学会誌 , 57 (1) , 34-38  (2011)

公開日・更新日

公開日
2018-06-21
更新日
-

収支報告書

文献番号
201034005Z
報告年月日

収入

(1)補助金交付額
13,000,000円
(2)補助金確定額
13,000,000円
差引額 [(1)-(2)]
0円

支出

研究費 (内訳) 直接研究費 物品費 0円
人件費・謝金 0円
旅費 0円
その他 0円
間接経費 0円
合計 0円

備考

備考
-

公開日・更新日

公開日
2017-05-30
更新日
-