腸管粘膜免疫組織パイエル板上皮細胞バリアの分子基盤に立脚した迅速かつ簡便な食物アレルギー予測評価系の開発

文献情報

• 文献番号: 201033051A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: 腸管粘膜免疫組織パイエル板上皮細胞バリアの分子基盤に立脚した迅速かつ簡便な食物アレルギー予測評価系の開発
• 課題番号: H21-食品・若手-019
• 研究年度: 平成22(2010)年度
• 研究代表者(所属機関): 近藤 昌夫(国立大学法人 大阪大学 大学院 薬学研究科)
• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 健康安全確保総合研究分野 食品の安心・安全確保推進研究
• 研究開始年度: 平成21(2009)年度
• 研究終了予定年度: 平成22(2010)年度
• 研究費: 6,409,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

本年度は、昨年度作製したレポーター活性を指標にしたCL-4バリア評価系を用いて、食品添加物のCL-4バリア制御活性を解析し、ヒット化合物についてCL-4発現制御活性、ヒト腸管モデル細胞系における粘膜バリア制御活性を解析し、食品添加物の粘膜バリア制御活性情報の集積を図ることを目的とした。

研究方法

前年度に単離したCL-4レポーター遺伝子安定発現細胞株を用い、88種類の食品添加物についてレポーター遺伝子発現細胞に対する細胞毒性を検討した。次に、細胞毒性を示さない濃度域で食品添加物を添加し、添加24時間後にルシフェラーゼ活性を解析した。レポーター活性の上昇、低下が観察された食品添加物についてCL-4 mRNAの発現制御能を解析し、ヒト腸管モデル細胞系であるCaco-2細胞の単層膜培養系を用い、膜電気抵抗値を指標に食品添加物の粘膜バリア制御活性を評価した。

結果と考察

解析した88種類の化合物のうち、1種類の化合物でCL-4発現低下活性、3種類の化合物でCL-4発現亢進活性が観察され、ヒト腸管細胞系においてそれぞれの粘膜バリア低下作用、亢進作用を有していた。
　　以上、CL-4バリア制御活性を指標にした食品添加物の安全性解析基盤を確立し、一部の化合物について安全性情報を集積した。また、CLバリアを強固にする活性を有する食品添加物を同定し、炎症性腸疾患に対する病態改善活性を有する機能性食品の開発シーズ、医薬シーズとしての応用の可能性を見出した。

結論

本年度は、88種類の食品添加物についてCL-4バリア制御活性を詳細解析し、1種類のCL-4バリア低下物質、3種類のCL-4バリア上昇物質の同定に成功した。今後は、腸管粘膜バリアを有することが知られているCL-1やCL-2などについてもバリア評価系を構築し、粘膜バリアの分子基盤に着目した食品添加物の安全性情報の集積を図る予定である。また、CL-4バリアを強固にする作用を有していた化合物について、機能性食品への応用などを視野に入れ、動物レベルでの解析を進めていく。

公開日・更新日

• 公開日: 2011-05-18
• 更新日: -

文献情報

• 文献番号: 201033051B
• 報告書区分: 総合
• 研究課題名: 腸管粘膜免疫組織パイエル板上皮細胞バリアの分子基盤に立脚した迅速かつ簡便な食物アレルギー予測評価系の開発
• 課題番号: H21-食品・若手-019
• 研究年度: 平成22(2010)年度
• 研究代表者(所属機関): 近藤 昌夫(国立大学法人 大阪大学 大学院 薬学研究科)
• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 健康安全確保総合研究分野 食品の安心・安全確保推進研究
• 研究開始年度: 平成21(2009)年度
• 研究終了予定年度: 平成22(2010)年度
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

本研究は、独自のclaudin（CL） modulatorを利用した創薬研究を有効活用し、腸管粘膜免疫組織パイエル板（PP）を覆う上皮細胞層バリアの分子基盤CLに着目した食品添加物の安全性情報を集積することを目的とした。

研究方法

本研究では、PPを覆う粘膜上皮細胞に高発現しているCL-4に焦点を絞り、CL-4バリア制御能を指標にした食物アレルギー予測評価系を構築し、食品添加物の安全性評価を実施した。
　　まず、CL-4のプロモーター領域をクローニングし、下流にレポーター遺伝子を結合したコンストラクトを作製、細胞に導入し、レポーター遺伝子安定発現細胞株を樹立した。本発現細胞株を用い、88種類の食品添加物についてレポーター活性を解析した。レポーター活性の上昇、低下が観察された食品添加物についてCL-4 mRNAの発現制御能を解析し、ヒト腸管モデルCaco-2細胞の単層膜培養系を用い粘膜バリア制御活性を評価した。

結果と考察

レポーター遺伝子安定発現細胞株を樹立し、CL-4発現変動作用を有するサイトカインなどを用いて本細胞株の中からCL-4発現モニター可能な細胞を選択した。88種類の食品添加物のレポーター活性を解析したところ、1種類の化合物でCL-4発現低下活性、3種類の化合物でCL-4発現亢進活性が観察され、それぞれのヒト腸管細胞系において粘膜バリア低下作用、亢進作用を有していた。
　　以上、CL-4のプロモーター領域を用いたレポーターアッセイシステムを確立し、本システムがCL-4モニターシステムとして機能することを見出した。さらに、88種類の食品添加物について安全性情報の集積を図り、CLバリアを強固にする活性を有する食品添加物を同定し、炎症性腸疾患に対する病態改善活性を有する機能性食品の開発シーズ、医薬シーズとしての応用の可能性を見出した。

結論

以上、現在までの検討により、レポーター活性を指標にした迅速かつ簡便なCLバリア制御活性モニターシステムを確立し、本システムを用いてCL-4バリア制御物質の同定に成功した。今後は、腸管粘膜バリアを担うCL-1やCL-2などについてもバリア評価系を構築し、粘膜バリアの分子基盤に着目した食品添加物の安全性情報の集積を図る予定である。また、CL-4バリアを強固にする作用を有していた化合物については、機能性食品への応用の可否について検証を進めていく予定である。

公開日・更新日

• 公開日: 2011-05-18
• 更新日: -

行政効果報告

• 文献番号: 201033051C

成果

• 専門的・学術的観点からの成果: レポーター活性を指標にした迅速かつ簡便なclaudin-4発現制御活性モニターシステムを開発し、claudin-4制御活性を有する食品添加物を4種類同定した。本成果を基に製薬企業との共同研究が開始され、産業界から注目されている。
• 臨床的観点からの成果: 特記事項なし
• ガイドライン等の開発: 特記事項なし
• その他行政的観点からの成果: 特記事項なし
• その他のインパクト: レポーター活性を指標にしたclaudinバリア制御分子探索系は本邦製薬企業に導出予定であり、当該分野の発展に貢献しつつある。

発表件数

• 原著論文（和文）: 0件
• 原著論文（英文等）: 16件
• その他論文(和文): 1件
• その他論文(英文等): 0件
• 学会発表(国内学会): 31件
• 学会発表(国際学会等): 12件
• その他成果(特許の出願): 0件 ; 「出願」「取得」計0件
• その他成果(特許の取得): 0件
• その他成果(施策への反映): 0件
• その他成果(普及・啓発活動): 0件

主な原著論文20編（論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限る）

• 原著論文1: Azusa Takahashi, Masuo Kondoh, Miki Kodaka et al.; Peptides as tight junction modulators; Curr Pharm Design (2011)
• 原著論文2: Azusa Takahashi, Masuo Kondoh, Hidehiko Suzuki et al.; Claudin as a target for drug development; Curr Med Chem , 18 , 1861-1865 (2011)
• 原著論文3: Hideki Kakutani, Azusa Takahashi, Masuo Kondoh et al.; A novel screening system for claudin binder using baculoviral display; PLos One , 6 (2011)
• 原著論文4: Rie Saeki, Masuo Kondoh, Hideki Kakutani et al.; A claudin-targeting molecule as an inhibitor of tumor metastasis; J Pharmacol Exp Ther , 334 , 576-582 (2010)
• 原著論文5: Hidehiko Suzuki, Hideki Kakutani, Masuo Kondoh et al.; The safety of a mucosal vaccine using the C-terminal fragment of Clostridium perfringens enterotoxin; Pharmazie , 10 , 766-769 (2010)
• 原著論文6: Hideki Kakutani, Masuo Kondoh, Masahiro Fukasaka et al.; Mucosal vaccination using claudin-4 targeting; Biomaterials , 31 , 5463-5471 (2010)
• 原著論文7: Hiroshi Uchida, Masuo Kondoh, Takeshi Hanada et al.; A claudin-4 modulator enhances the mucosal absorption of a biologically active peptide; Biochem Pharmacol , 79 , 1437-1444 (2010)
• 原著論文8: Rie Saeki, Masuo Kondoh, Hiroshi Uchida et al.; Potency of claudin-targeting as antitumor therapy; Mol Cell Pharmacol , 2 , 47-51 (2010)
• 原著論文9: Hideki Kakutani, Masuo Kondoh, Rie Saeki et al.; Claudin-4-targeting of diphtheria toxin fragment A using a C-terminal fragment of Clostridium perfringens enterotoxin; Eur J Pharm Biopharm , 75 , 213-217 (2010)
• 原著論文10: Akihiro Watara, Kiyohito Yagi, Masuo Kondoh; A simple reporter assay for screening claudin-4 modulators; Biochem Biophys Res Commun , 426 , 454-460 (2012)

公開日・更新日

• 公開日: 2014-06-02
• 更新日: -

収支報告書

• 文献番号: 201033051Z