文献情報
文献番号
201029038A
報告書区分
総括
研究課題名
エイズ感染細胞での配列特異的遺伝子組換えによる効率的なHIV遺伝子除去法の開発
研究課題名（英字）
-
課題番号
H20-エイズ・若手-016
研究年度
平成22(2010)年度
研究代表者(所属機関)
野村 渉(東京医科歯科大学 生体材料工学研究所)
研究分担者(所属機関)
研究区分
厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 エイズ対策研究
研究開始年度
平成20(2008)年度
研究終了予定年度
平成22(2010)年度
研究費
3,000,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
現在のHIV感染患者における治療は、多剤併用療法が主流であり成果を挙げている。しかし、副作用や高額な医療費、エスケープミュータントの発生などが問題となっている。本研究では、特定の遺伝子配列に対して働くDNA組換え酵素を用いて感染細胞のゲノム中に組み込まれたHIV-1プロウイルス遺伝子を除去するという新規な治療法の開発を行う。
研究方法
保存度の高いgag-pol遺伝子配列を標的とした。DNA結合活性が確認されたジンクフィンガータンパク質（ZFP）に組換え酵素ドメインTn3を融合させ、酵素活性の確認を行う。哺乳類細胞内での酵素活性評価は、標的となるgag遺伝子配列を両端に置いた蛍光タンパク質遺伝子をレポーターとして用いた。このプラスミド遺伝子をCHO-K1細胞に導入して安定的にレポーターを発現する細胞株を樹立する。ZFP融合型DNA組み換え酵素（RecZF）の哺乳類細胞への導入はアデノウイルスベクターを用いることで高い効率での遺伝子導入に関して検討を行う。細胞内へのRecZFの導入についてはウェスタンブロッティングによって発現確認によって行った。
結果と考察
RecZFのZFPドメイン、酵素ドメイン間をつなぐリンカー配列に関してさまざまな変異体を構築して大腸菌内で組み換え反応効率を定量した結果、最適なリンカー長を決定できた。また、長さのみではなくアミノ酸の種類も重要であることが明らかになった。感染細胞における組み換え反応は細胞への導入効率を向上させるためにウイルスベクターを用いる方法を採用し、ウイルス力価の最適化が行えた。標的遺伝子のモデル配列を安定的に導入したレポーター細胞を用いて4種類の異なる配列を認識するRecZFの酵素活性をFACSによって定量した結果、24%程度の組み換え効率が得られた。各融合酵素の発現はウェスタンブロッティングによって確認された。
結論
細胞内における酵素の反応効率について標的モデル配列を用いた反応系ではアデノウイルスベクターによる遺伝子導入を用いることで24%程度という値が得られた。さらに高い活性を得るために酵素活性ドメインの最適化が必要である。また、標的配列周辺のクロマチン構造がDNA結合の障壁となる可能性があるため、ChIPアッセイでの確認に取り組んでいる。今後は分子進化法によってアミノ酸配列を最適化した高い活性を持つ酵素ドメインを見出すことが重要になると考えられる。RecZFはジンクフィンガードメインによって多様な標的配列に適用できると期待されている。そのため、標的配列に対する反応効率の最適化に関する知見は今後重要になると考えられる。
公開日・更新日
公開日
2014-05-26
更新日
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