神経・筋疾患のRNAiを用いた画期的治療法の開発

文献情報

• 文献番号: 201027065A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: 神経・筋疾患のRNAiを用いた画期的治療法の開発
• 課題番号: H20-こころ・一般-019
• 研究年度: 平成22(2010)年度
• 研究代表者(所属機関): 水澤 英洋(東京医科歯科大学大学院医歯学総合研究科 脳神経病態学分野)

研究分担者(所属機関)

• 横田　隆徳(東京医科歯科大学大学院医歯学総合研究科　脳神経病態学分野 )
• 木村　展之(独立行政法人医薬基盤研究所　霊長類医科学研究センター)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 障害者対策総合研究
• 研究開始年度: 平成20(2008)年度
• 研究終了予定年度: 平成22(2010)年度
• 研究費: 24,000,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

siRNAを用いて神経変性疾患、脳血管障害のsiRNA/shRNAによる遺伝子治療を行う。

研究方法

1)脳血管内皮細胞へのsiRNAデリバリー：脳内では脳血管内皮細胞にのみ発現するorganic anion transporter (OAT3) を標的遺伝子としたsiRNAを設計し、センス鎖の3’末端にcholesterolを共有結合させた (Chol-siOAT3)。Cy3標識したChol-siOAT3 (10mg/kg) をHDLに包含させてマウス尾静脈から6時間毎に3回投与し、24時間後に脳を摘出して微小血管分画を分離し、脳血管内皮細胞でOAT3遺伝子抑制効果を検証した。２) 骨格筋へのsiRNAデリバリー：新生児マウス腹腔内にSOD1を標的とした1x10E11vgのshRNA発現AAV9を投与して4週後、肝臓、心筋、骨格筋（大腿四頭筋、ハムストリング）の病理検索とSOD1のウエスタンブロット、RT-PCR,ノザンブロットを行いその効果を判定した。

結果と考察

1)内在性リポ蛋白をベクターとして生体内でshort-interfering RNA (siRNA) をin vivo デリバリーすることで脳血管内皮細胞における遺伝子発現を抑制する方法を開発し、脳血管内皮細胞が病態形成に関わるAlzheimer病、脳梗塞、多発性硬化症といった様々な疾患に対する新たな遺伝子治療として臨床応用しうる大きな可能性を明らかにした。2)遺伝性筋疾患の遺伝子治療のための基礎実験として、アデノ随伴ウイルスベクター（AAV）とshRNAを用いて骨格筋における標的遺伝子抑制を検討した結果、AAV9型ベクターで胎児マウスの腹腔内にshRNAを投与する方法は、明らかな副作用を生じることなく、骨格筋で標的遺伝子を抑制できた。このことは先天性筋疾患での遺伝子治療の大きな可能性を示した。

結論

1)内在性リポ蛋白を用いた脳血管内皮細胞への効果的なsiRNAのデリバリー法を初めて開発した。脳血管内皮細胞が病態形成に関わるAlzheimer病、脳梗塞、多発性硬化症といった様々な疾患に対して、新たな遺伝子治療として応用できることが期待される。2)shRNAをAAV9に組み込み新生児マウスの腹腔内投与することで、骨格筋で有意な標的遺伝子抑制に成功し、遺伝性筋疾患に対するshRNA遺伝子治療の可能性を示した。

公開日・更新日

• 公開日: 2011-06-09
• 更新日: -

文献情報

• 文献番号: 201027065B
• 報告書区分: 総合
• 研究課題名: 神経・筋疾患のRNAiを用いた画期的治療法の開発
• 課題番号: H20-こころ・一般-019
• 研究年度: 平成22(2010)年度
• 研究代表者(所属機関): 水澤 英洋(東京医科歯科大学大学院医歯学総合研究科 脳神経病態学分野)

研究分担者(所属機関)

• 横田　隆徳(東京医科歯科大学大学院医歯学総合研究科　脳神経病態学分野 )
• 木村　展之(独立行政法人医薬基盤研究所　霊長類医科学研究センター)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 障害者対策総合研究
• 研究開始年度: 平成20(2008)年度
• 研究終了予定年度: 平成22(2010)年度
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

siRNAを用いて神経変性疾患、脳血管障害のsiRNA/shRNAによる遺伝子治療を行う。

研究方法

shRNA発現アデノ随伴ウイルスベクター(AAV)8/9作製はStratageneのキットでHEK293細胞に導入し、Iodexanolで精製した。すべての動物実験は東京医科歯科大学動物実験委員会、医薬基盤研医科学霊長類センターの審査と許可を得て行ない、動物の苦痛を除く最大限の努力をした。

結果と考察

1)肝臓で産生される変異transthyretin(TTR)が末梢神経に沈着して発症する家族性アミロイドポリニューロパチー(FAP)に対し、TTRに対するsiRNAを肝臓への組織特異性の高いAAV8型を用いてFAPモデルマウス及びヒト肝細胞キメラマウスやカニクイザルへ投与を試み、TTRの発現を長期にかつ顕著に抑制することに成功し、shRNAのFAPへの臨床応用に大きな可能性を明らかにした。2) すでに開発したshRNA高発現トランスジェニックマウスの脳において、標的遺伝子の顕著な抑制下にあっても、長期間の遺伝子治療の副作用として懸念されたmiRNAの過剰飽和効果はないことを明らかにし、shRNAの神経変性疾患への臨床応用の原理的な安全性を示した。3) 血清中の内在性リポ蛋白をベクターとしてshort-interfering RNA (siRNA) を脳室内持続投与することで脳神経細胞における遺伝子発現を抑制する方法を開発した。4)同様に内在性リポ蛋白をベクターとしてsiRNA を静脈投与することで脳血管内皮細胞における遺伝子発現を抑制する方法を開発し、Alzheimer病、脳梗塞といった様々な神経疾患に対する新たな遺伝子治療として臨床応用しうる可能性を明らかにした。5)遺伝性筋疾患の遺伝子治療のための基礎実験として、AAV9型ベクターで新生児マウスの腹腔内にshRNAを投与する方法により、shRNAによる肝毒性を回避して骨格筋で標的遺伝子を抑制でき、先天性筋疾患での遺伝子治療の可能性を示した。6)遺伝子治療の検証に必要な筋萎縮性側索硬化症（ALS）のサルモデルを作製して、神経病理学的にブニナ小体様の肥大化cystatin-c陽性顆粒蓄積像が確認した。

結論

FAPに対するshRNA遺伝子治療の有用性を霊長類で明らかにし、中枢神経系への新規siRNAデリバリー方法を開発した。

公開日・更新日

• 公開日: 2011-06-09
• 更新日: -

行政効果報告

• 文献番号: 201027065C

成果

• 専門的・学術的観点からの成果: 特許申請中の、ビタミンEの代謝系を利用した内在性リポ蛋白をベクターとした独自のデリバリー方法を応用して、siRNAの経脳室投与による神経細胞への導入、経静脈投与による骨格筋と脳血液関門の脳血管内皮細胞への導入とそれらの内因性遺伝子の発現抑制に成功して、神経筋への新規のsiRNAのデリバリーシステムを構築した。さらに、shRNAの長期の安全性について、独自に開発したshRNAトランスジェニックマウスを用いて、懸念されているmiRNA成熟の競合的阻害副作用がないことを示した。
• 臨床的観点からの成果: 家族性アミロイドポリニューロパチーに対し、TTRに対するsiRNAを肝臓への組織特異性の高いアデノ随伴ウイルスベクター(AAV)8型を用いてFAPモデルマウス及びヒト肝細胞キメラマウスやカニクイザルへshRNA投与を試み、TTRの発現を長期にかつ顕著に抑制することに成功した。さらにカニクイザルで一般臨床的な腹部臓器の副作用の検索を行い本治療法が安全であることを示した。以上から、AAVshRNAの家族性アミロイドポリニューロパチーへの臨床応用に大きな可能性を明らかにした。
• ガイドライン等の開発: なし
• その他行政的観点からの成果: 肝臓移植しか治療方法のない家族性アミロイドポリニューロパチーに、1回の投与で長期間効果が継続するAAVベクターによる遺伝子治療法の有効性、安全性を霊長類モデルを用いて検証した。さらに高齢化社会で最大の問題になっているアルツハイマー型認知症の遺伝子治療を可能する新規のsiRNAデリバリー方法と海馬や大脳皮質のβセクレターゼの抑制に成功し、社会的問題となっている神経難病に新たな治療的側面を切り開いた。
• その他のインパクト: なし

発表件数

• 原著論文（和文）: 2件
• 原著論文（英文等）: 10件
• その他論文(和文): 4件
• その他論文(英文等): 0件
• 学会発表(国内学会): 12件
• 学会発表(国際学会等): 3件
• その他成果(特許の出願): 0件 ; 「出願」「取得」計1件
• その他成果(特許の取得): 0件
• その他成果(施策への反映): 0件
• その他成果(普及・啓発活動): 0件

主な原著論文20編（論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限る）

• 原著論文1: Nishina K, Mizusawa H, Yokota, et al. ; Efficient In Vivo delivery of siRNA to liver by conjugation of α-Tocopherol; Molecular Therapy , 16 , 734-740 (2008)
• 原著論文2: Sakamoto N, Tanabe Y, Yokota T, et al.; Inhibition of hepatitis C virus infection and expression in vitro and in vivo by recombinant adenovirus expressing short hairpin RNA; Journal of Gastroenterology and Hepatology , 23 (9) , 1437-1447 (2008)
• 原著論文3: Rossi D, Brambilla L, Yokota T, et al.; Focal degeneration of astrocytes in amyotrophic lateral sclerosis; Cell death and differentiation , 15 (11) , 1691-1700 (2008)
• 原著論文4: Nishitoh H, Kadowaki H, Yokota T, et al; ALS-linked mutant SOD1 induces ER stress- and ASK1-dependent motor neuron death by targeting Derlin-1; Genes & Development , 22 (11) , 1451-1464 (2008)
• 原著論文5: Sasaguri H, Mizusawa H, Yokota T, et al.; Difference in silencing efficiency among tissues and lack of oversaturation of microRNA pathway in short hairpin RNA transgenic mice; FEBS Letters , 583 (1) , 213-218 (2009)
• 原著論文6: Kubodera T, Mizusawa H, Yokota T, et al.; In Vivo application of an RNAi strategy for the selective suppression of a mutant allele; Human Gene Therapy , 22 (1) , 27-34 (2011)
• 原著論文7: Mayra A, Mizusawa H, Yokota T, et al.; Intraperitoneal AAV9-shRNA inhibits target expression in neonatal skeletal and cardiac muscles; Biophysical Research Communications , 405 (2) , 204-209 (2011)
• 原著論文8: Uno Y, Mizusawa H, Yokota T, et al.; HDL facilitates in vivo delivery of a-tocopherol- conjugated siRNA to the brain(ahead of print); Human Gene Therapy (2011)
• 原著論文9: Okabayashi S, Kimura N.; LGI3 interacts with flotillin-1 to mediate APP trafficking and exosome formation; Neuroreport , 21 (9) , 606-610 (2010)
• 原著論文10: Oikawa N, Kimura N, Yanagisawa K.; Alzheimer-type tau pathology in advanced aged nonhuman primate brains harboring substantial amyloid deposition ; Brain Research , 1315 , 137-149 (2010)
• 原著論文11: 久保寺隆行, 横田隆徳, 水澤英洋.; ALSの遺伝子治療; Clinical Neuroscience , 26 (3) , 337-339 (2008)
• 原著論文12: 久保寺隆行, 横田隆徳.; ウイルスベクターを用いたshRNAによる遺伝子治療の現状と問題点; Antisense , 12 , 37-47 (2008)

公開日・更新日

• 公開日: 2015-05-20
• 更新日: -

収支報告書

• 文献番号: 201027065Z