インフルエンザウイルスによる病原性発現の分子機構に関する研究

文献情報

• 文献番号: 199700833A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: インフルエンザウイルスによる病原性発現の分子機構に関する研究
• 課題番号: -
• 研究年度: 平成9(1997)年度
• 研究代表者(所属機関): 滝澤 剛則(愛知県心身障害者発達障害研究所)
• 研究区分: 厚生科学研究費補助金 先端的厚生科学研究分野 新興・再興感染症研究事業
• 研究開始年度: 平成9(1997)年度
• 研究終了予定年度: 平成10(1998)年度
• 研究費: 1,000,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

インフルエンザウイルスは広範囲に流行を繰り返し、社会的影響のきわめて大きいウイルスでありながら、その病原性を引き起こすメカニズムはほとんどわかっていない。本研究では、インフルエンザウイルスによる病原性を、アポトーシスに関わるシステインプロテアーゼであるカスパーゼの活性化の側面から明らかにすることにより、ウイルス弱毒化、予防、治療に応用することを目的とした。

研究方法

1、インフルエンザウイルス感染によるカスパーゼ活性化。培養細胞を用いて、ウイルス感染細胞抽出液でのカスパーゼ-1、3の活性をペプチド基質を用いて測定した。また、カスパーゼは活性化される前にプロテアーゼで切断されて短くなるため、ウイルス感染細胞で実際プロセスされるかどうかを、カスパーゼ3に対する抗体を用いてウェスタンブロットで検討した。2、カスパーゼ阻害因子の影響。カスパーゼ阻害ペプチドを用いて、カスパーゼを抑制したときの宿主細胞死への影響を検討した。ペプチド阻害剤は、z-VAD-fmk(広域阻害剤、以下同)、z-IETD-fmk(カスパーゼ-8)、Ac-DEVD-CHO(カスパーゼ-3)、 Ac-YVAD-CHO(カスパーゼ-1)を用いた。また、ウイルスの持つカスパーゼ阻害因子であるcrmA、v-FLIP遺伝子を細胞に導入してその効果を検討した。3、カスパーゼ阻害ペプチドのウイルス複製に及ぼす影響。培養細胞にウイルス感染後、35S-メチオニンを用いて、ウイルスの蛋白合成へのカスパーゼ阻害ペプチドの影響を検討した。また、培養上清のウイルス力価をプラーク形成能で測定することにより、ウイルス複製への影響を検討した。

結果と考察

1、ウイルス感染によって、カスパーゼ-3は速やかに切断され、それに伴って細胞抽出液中のカスパーゼ-3活性が増加した。しかしながら、カスパーゼ-1の活性は増加しなかった。2、z-VAD-fmk、z-IETD-fmkによりウイルス感染による細胞死が顕著に抑制された。しかしながら、Ac-DEVD-CHOは部分的にしか効かず、Ac-YVAD-CHOはほとんど効果がなかった。一方、crmA、v-FLIP遺伝子を導入することで、ウイルス感染による細胞死が抑制された。3、実験に用いたペプチド阻害剤は、いずれもウイルスの蛋白合成及び培養上清のウイルス力価に影響を及ぼさなかった。以上から、インフルエンザウイルスにより、少なくともカスパーゼ-3の活性化が起こり、それより上流のカスパーゼ-8を抑制することにより細胞障害が抑制されることが示された。いずれもカスパーゼ-8の阻害因子であるcrmA、v-FLIP遺伝子産物も、カスパーゼ-8阻害ペプチドと同様の効果を示した。しかしながら、カスパーゼ-1の活性化は起こらず、またカスパーゼ-1、3阻害剤では宿主細胞死はあまり抑制されないことがわかった。カスペース-3は活性化されるにも関わらず、それを抑制しても細胞死があまり阻害されないのは、恐らく、カスペース-3非依存性のプロセスも同時に進行しているためと考えられる。カスペース-8は、カスペース-3よりも上流に位置するために効果があると考えられる。カスペース-8は、FasやTNFなどアポトーシス受容体の直下に位置することから、今回の結果は、インフルエンザウイルス感染によってFasが活性化するという、主任研究者らのこれまでの報告と合致するものと考えられた。今回用いたカスペース阻害ペプチドは、いずれもウイルスの複製を抑制しなかったことから、ウイルス感染によるカスペース活性化は、ウイルス複製よりも下流に位置するものと考えられた。したがって、カスペース阻害剤は、ウイルス複製を確保しながら、ウイルスによる細胞障害を軽減するという目的に使用できる可能性が考えられた。

結論

インフルエンザウイルス感染により、アポトーシスに関わる
カスペースが活性化すること、また、最も上流に位置するカスペースを阻害することにより、細胞障害が抑制されることが示された。その際、ウイルス複製は抑制されないことから、カスペース活性化はウイルス複製の下流に位置するものと考えられた。

公開日・更新日

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