フードチェインを基盤とする真菌・カビ毒の定量的な微生物リスク評価・管理実現のための予測モデル開発に関する研究

文献情報

• 文献番号: 202523026A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: フードチェインを基盤とする真菌・カビ毒の定量的な微生物リスク評価・管理実現のための予測モデル開発に関する研究
• 研究課題名（英字）: -
• 課題番号: 25KA3001
• 研究年度: 令和7(2025)年度
• 研究代表者(所属機関): 安部 大樹(国立医薬品食品衛生研究所 衛生微生物部)
• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 健康安全確保総合研究分野 食品の安全確保推進研究
• 研究開始年度: 令和7(2025)年度
• 研究終了予定年度: 令和9(2027)年度
• 研究費: 2,900,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

かび毒は、糸状菌が産生する二次代謝産物であり、人体に対して急性または慢性の毒性を示す化学物質である。近年、食品の保存温度・期間や、pH・水分活性などの環境情報をもとにして加工や保存中などのフードチェイン中における健康危害リスクの増減を定量的に予測・評価し、適切なリスク管理に利用する定量的微生物リスク評価が注目されている。しかし，現状では対象のほとんどが細菌のみであり、かび毒はその対象となっていない。定量的微生物リスク評価の実施のためには保存・流通中の増殖量予測モデルが必要であるが、糸状菌の増殖量予測モデルの開発には定量法における課題が問題となっている。本研究では糸状菌増殖量予測モデルの開発のための菌体量の定量法として新たにリアルタイムPCR法を提案・検討し、菌体量およびかび毒産生量を数理モデルによって予測する手法を開発することを目的とし、本年度はリアルタイムPCRによる糸状菌定量法の検討と確立を目的として研究を進めた。

研究方法

糸状菌の定量法としてリアルタイムPCR法の確立を行うため、糸状菌からの効率的なDNA抽出法の検討、各糸状菌を特異的に検出するリアルタイムPCRプライマーの検討・設計、
および検証を行った手法を用いて糸状菌増殖量および毒素産生量を測定した。DNA抽出のための細胞壁処理法として、酵素消化法、プロトプラスト化法、尿素緩衝液法の3種類、DNAの精製法としてシリカゲルカラム法とフェノール・クロロホルム法の2種類を組み合わせた計6種類のDNA抽出法について比較検討を行った。アフラトキシン産生糸状菌のAspergillus parasiticusおよびオクラトキシンA産生糸状菌のPenicillium verrucosumを供試菌として用いて、25°Cで５日間の静置培養後の菌体から凍結乾燥後にDNA抽出を行った。得られたDNA抽出液をテンプレートとしてリアルタイムPCRを行うことでCt値の比較を行った。また、プベルル酸産生糸状菌であるP. adametzioidesを特異的に検出するPCRプライマーを設計した。P. adametzioides 5菌株とP. adametzioides以外のPenicillium属糸状菌10菌株からDNAを抽出し、リアルタイムPCR反応を行い、増幅特異性について確認した。最後に、アフラトキシン産生糸状菌のA. parasiticusおよびプベルル酸産生糸状菌のP. adametzioidesの25°Cにおける菌体重量の増加挙動をリアルタイムPCR法によって定量し、かび毒産生量をHPLCによって測定した。

結果と考察

DNA抽出法の比較の結果、最もCt値の低い方法はA. parasiticusおよびP. verrucosum共に尿素緩衝液を用いた方法のDNA抽出効率が高かった。また、尿素緩衝液-シリカゲルカラム法が最もサンプル処理の所要時間が短く、リアルタイムPCRを用いた菌体量推定のための糸状菌DNA抽出法として適したDNA抽出法であることが示された。P. adametzioidesのβ-チューブリンを標的として開発したPCRプライマーの検証の結果、作成した3種類のうち2種類のプライマーで特異的にDNA配列を増幅することが確認された。また、A. parasiticus およびP. adametzioides の培養実験を行った結果、増殖挙動と毒素産生時期に差異が認められた。増殖に関してはA. parasiticus は培養開始後4日目、P. adametzioides は3日目にそれぞれ増殖の上限に達した一方、毒素産生についてはA. parasiticus では増殖初期段階にあたる培養2日目からアフラトキシンの産生が検出されたのに対し、P. adametzioides では増殖が上限に達した培養3日目以降にプベルル酸の産生が確認された。このような毒素産生時期の違いは食品汚染リスクの観点から重要であり、特にアフラトキシンについては菌の増殖が顕著でない初期段階においても汚染が進行する可能性が示唆されたため、より一層の注意が必要である。

結論

菌体増殖量予測モデル開発のための菌体量定量を目的としたリアルタイムPCRのために、尿素誘導変性とシリカゲルカラムを組み合わせた手法がかび毒産生糸状菌からの効率的なDNA抽出法であることを示した。また、プベルル酸産生糸状菌を特異的に検出する定量PCRプライマーの設計および検証を行った。本年度に検討した定量PCR法によって、菌体重量の増殖挙動を推定し、毒素産生の挙動を明らかにした。今後は本年度検証した菌体定量法を用いて各かび毒産生糸状菌の増殖温度による菌体増加量への影響をかび毒産生への影響を測定し、それぞれの予測モデルを開発する予定である。

公開日・更新日

• 公開日: 2026-08-07
• 更新日: -

収支報告書

• 文献番号: 202523026Z