ヒトｉＰＳ細胞等応用による新規細胞評価系構築のための基盤研究

文献情報

• 文献番号: 201008030A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: ヒトｉＰＳ細胞等応用による新規細胞評価系構築のための基盤研究
• 課題番号: H20-生物資源・指定-007
• 研究年度: 平成22(2010)年度
• 研究代表者(所属機関): 水口 裕之(独立行政法人医薬基盤研究所 基盤的研究部 幹細胞制御プロジェクト)

研究分担者(所属機関)

• 古江　美保(独立行政法人医薬基盤研究所　難病・疾患資源研究部　培養資源研究室)
• 高橋　一朗(独立行政法人医薬基盤研究所　難病・疾患資源研究部　難病資源研究室)
• 梅澤　明弘(国立成育医療センター研究所　生殖医療研究部)
• 形山　和史(大阪大学大学院薬学研究科　分子薬科学専攻　分子生物学分野)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 厚生科学基盤研究分野 創薬基盤推進研究（創薬総合推進研究）
• 研究開始年度: 平成20(2008)年度
• 研究終了予定年度: 平成22(2010)年度
• 研究費: 86,153,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

細胞を用いたin vitroアッセイは、様々な安全性・有効性評価のための創薬研究に用いられるが、細胞において測定可能な評価項目は限られていること等、その結果の解釈には限界があった。また、創薬研究にこれまで用いられてきた様々な培養細胞の他、より生体組織に近い性質・機能を有した胚性幹細胞（ES細胞）や各種幹細胞の利用について研究がなされているが、分化制御等が不十分であり、再現性・安定供給に問題が認められた。本研究では、創薬研究の加速化および非臨床データのヒトへの外挿性向上等のため、ヒト由来各種幹細胞を用いたin vitro安全性・有効性評価系開発のための基盤研究を行う。

研究方法

本研究は、主任研究者 1 名、分担研究者 4 名の計 5 名が遂行した。当該年度においては、主にヒト iPS 細胞から肝細胞への分化誘導、iPS 細胞分化効率の予測、iPS 細胞未分化評価法の確立、iPS 細胞作製法の改良、に分けて遂行された。

結果と考察

アデノウイルスベクターを用いて、ヒト iPS 細胞から分化誘導した中内胚葉にSOX17 遺伝子を導入し、そこから得られた内胚葉に HEX 遺伝子を導入し、さらにそこから得られた肝幹前駆細胞に HNF4a 遺伝子を導入することにより、高い薬物代謝酵素活性を有する成熟した肝細胞を効率良く分化誘導することに成功した。未分化状態でのヒト iPS 細胞の特性解析を行った結果、ヒト ES 細胞と iPS 細胞、ならびにヒト EC 細胞において、未分化マーカー遺伝子、あるいは早期分化マーカー遺伝子の発現において大きな発現の差は見られなかった。バイオインフォマティクス的手法を用いた包括的な解析を行い、再現性のある品質評価手法を確立した。アデノウイルスベクターが iPS 細胞の作製を阻害していること、その阻害効果は外来遺伝子導入効率とは相関しないことを明らかにした。

結論

・ヒトiPS細胞からの高効率肝細胞成熟化誘導法を開発した。
・ヒトiPS細胞の継代による経時的評価をし、iPS細胞の細胞特性が維持できているかを検証した。また、ゲノムレベル、エピゲノムレベルでの安定性に関しての解析を加え品質評価技術の基盤整備が整った。

公開日・更新日

• 公開日: 2011-05-25
• 更新日: -

文献情報

• 文献番号: 201008030B
• 報告書区分: 総合
• 研究課題名: ヒトｉＰＳ細胞等応用による新規細胞評価系構築のための基盤研究
• 課題番号: H20-生物資源・指定-007
• 研究年度: 平成22(2010)年度
• 研究代表者(所属機関): 水口 裕之(独立行政法人医薬基盤研究所 基盤的研究部 幹細胞制御プロジェクト)

研究分担者(所属機関)

• 古江　美保(独立行政法人医薬基盤研究所　難病・疾患資源研究部　培養資源研究室)
• 高橋　一朗(独立行政法人医薬基盤研究所　難病・疾患資源研究部　難病資源研究室)
• 梅澤　明弘(国立成育医療センター研究所　生殖医療研究部)
• 形山　和史(大阪大学大学院薬学研究科　分子薬科学専攻　分子生物学分野)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 厚生科学基盤研究分野 創薬基盤推進研究（創薬総合推進研究）
• 研究開始年度: 平成20(2008)年度
• 研究終了予定年度: 平成22(2010)年度
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

細胞を用いたin vitroアッセイは、様々な安全性・有効性評価のための創薬研究に用いられるが、細胞において測定可能な評価項目は限られていること等、その結果の解釈には限界があった。また、創薬研究にこれまで用いられてきた様々な培養細胞の他、より生体組織に近い性質・機能を有した胚性幹細胞（ES細胞）や各種幹細胞の利用について研究がなされているが、分化制御等が不十分であり、再現性・安定供給に問題が認められた。本研究では、創薬研究の加速化および非臨床データのヒトへの外挿性向上等のため、ヒト由来各種幹細胞を用いたin vitro安全性・有効性評価系開発のための基盤研究を行う。

研究方法

本研究は、主任研究者 1 名、分担研究者 4 名の計 5 名が遂行した。具体的には、iPS 細胞への高効率遺伝子導入法の開発、iPS 細胞からの成熟肝細胞への高効率分化誘導法の開発、ハイスループットな内胚葉分化誘導効率評価方法の開発、バイオインフォマティクス的手法を用いた iPS 細胞の未分化性評価、およびアデノウイルスベクターを用いた iPS 細胞の作製等を行った。

結果と考察

ヒト iPS 細胞への高効率遺伝子導入法を開発した。SOX17、HEX、HNF4a の 3 種の遺伝子を順次導入することにより、高い薬物代謝酵素活性を有する成熟肝細胞を分化誘導することができた。本研究で確立した内胚葉分化プロトコールを用いて、肝細胞への分化効率を予測することが可能となった。再現性のある iPS 細胞未分化培養法および評価法を確立した。レトロ、レンチ、アデノウイルスベクターの 3 種のベクターを用いてヒト iPS 細胞の作製を試みた結果、レンチウイルスベクターを利用した場合の作製効率が最も高かった。また、アデノウイルスベクターが iPS 細胞の作製を阻害していること、その阻害効果は外来遺伝子導入効率とは相関しないことが明らかとなった。

結論

・ヒトiPS細胞からの高効率肝細胞分化・成熟化誘導法を開発した。
・ヒトiPS細胞の未分化マーカーによる評価系について経時的安定性について検証し品質管理技術をほぼ確立できた。

公開日・更新日

• 公開日: 2011-05-25
• 更新日: -

行政効果報告

• 文献番号: 201008030C

成果

• 専門的・学術的観点からの成果: ヒト iPS 細胞への高効率遺伝子導入法を開発し、SOX17、HEX、HNF4a の 3 種の遺伝子を順次導入することにより、高い薬物代謝酵素活性を有する成熟肝細胞を分化誘導することができた。本研究で確立した内胚葉分化プロトコールを用いて、肝細胞への分化効率を予測することが可能となった。さらに、再現性のある iPS 細胞未分化培養法および評価法を確立した。
• 臨床的観点からの成果: 創薬研究にはこれまで用いられてきた様々な幹細胞の利用について研究がなされているが、分化制御等が不十分であり、再現性・安定供給に問題が存在していた。本研究では、ヒトiPS 細胞を用いたin vitro安全性・有効性評価系開発のための基盤研究を行い、創薬研究の加速化および非臨床データのヒトへの外挿性向上等に関する基盤技術を開発した。
• ガイドライン等の開発: 本研究で得られた知見は、新規薬物毒性評価系のガイドライン案の作成に向けて重要な情報となる。
• その他行政的観点からの成果: 本研究により創薬の加速化が達成できれば、保健医療の向上が期待できる。
• その他のインパクト: iPS 細胞から肝細胞を分化誘導する研究に関し、数多くの新聞等に取り上げられた。また、招待講演も多数こなした。

発表件数

• 原著論文（和文）: 6件
• 原著論文（英文等）: 34件
• その他論文(和文): 1件
• その他論文(英文等): 0件
• 学会発表(国内学会): 50件
• 学会発表(国際学会等): 6件
• その他成果(特許の出願): 2件 ; 「出願」「取得」計2件
• その他成果(特許の取得): 0件
• その他成果(施策への反映): 0件
• その他成果(普及・啓発活動): 0件

主な原著論文20編（論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限る）

• 原著論文1: Inamura M., Kawabata K., Takayama K. et al.; Efficient generation of hepatoblasts from human ES cells and iPS cells by transient overexpression of homeobox gene HEX.; Mol. Ther. , 19 , 400-407 (2011)
• 原著論文2: Yamaguchi T., Kawabata K., Kouyama E. et al.; Differentiation of functional cells from iPS cells by efficient gene transfer. ; 薬学雑誌 , 130 , 1527-1534 (2010)
• 原著論文3: Tashiro K., Kawabata K., Inamura M. et al.; Adenovirus vector-mediated efficient transduction into human embryonic and induced pluripotent stem cells.; Cell Reprogram. , 12 , 501-507 (2010)
• 原著論文4: Tashiro K., Inamura M., Kawabata K. et al.; Efficient adipocyte and osteoblast differentiation from mouse induced pluripotent stem cells by adenoviral transduction. ; Stem Cells , 27 , 102-111 (2009)
• 原著論文5: Tashiro K., Kondo A., Kawabata K. et al.; Efficient osteoblast differentiation from mouse bone marrow stromal cells with polylysin-modified adenovirus vectors. ; Biochem. Biophys. Res. Commun. , 379 , 127-132 (2009)
• 原著論文6: Tashiro K., Kawabata K., Sakurai H. et al.; Efficient adenovirus vector-mediated PPAR gamma gene transfer into mouse embryoid bodies promotes adipocyte differentiation. ; J. Gene Med. , 10 , 498-507 (2008)
• 原著論文7: Toyoda M., Yamazaki-Inoue M., Itakura Y. et al.; Lectin microarray analysis of pluripotent and multipotent stem cells.; Genes Cells , 16 , 1-11 (2011)
• 原著論文8: Nishino K., Toyoda M., Yamazaki-Inoue M. et al.; Defining hypo-methylated regions of stem cell-specific promoters in human iPS cells derived from extra-embryonic amnions and lung fibroblasts.; PLoS One , 5 , 13017- (2010)
• 原著論文9: Sasaki N., Hirano T., Kobayashi K. et al.; Chemical inhibition of sulfation accelerates neural differentiation of mouse embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells.; Biochem. Biophys. Res. Commun. , 401 , 480-486 (2010)
• 原著論文10: Toyoda M., Hamatani T., Okada H. et al.; Defining cell identity by comprehensive gene expression profiling.; Curr. Med. Chem. , 17 , 3245-3252 (2010)
• 原著論文11: Adachi T., Wang X., Murata T. et al.; Production of a non-triple helical collagen alpha chain in transgenic silkworms and its evaluation as a gelatin substitute for cell culture.; Biotechnol. Bioeng. , 106 , 860-870 (2010)
• 原著論文12: Fujino T., Nomura K., Ishikawa Y.; Function of EWS-POU5F1 in sarcomagenesis and tumor cell maintenance.; Am. J. Pathol. , 176 , 1973-1982 (2010)
• 原著論文13: Nagata S., Toyoda M., Yamaguchi S. et al.; Efficient reprogramming of human and mouse primary extra-embryonic cells to pluripotent stem cells.; Genes Cells , 14 , 1395-1404 (2009)
• 原著論文14: Makino H., Toyoda M., Matsumoto K. et al.; Mesenchymal to embryonic incomplete transition of human cells by chimeric OCT4/3 (POU5F1) with physiological co-activator EWS.; Exp. Cell Res. , 315 , 2727-2740 (2009)

公開日・更新日

• 公開日: 2015-05-27
• 更新日: -

収支報告書

• 文献番号: 201008030Z