文献情報
文献番号
201008011A
報告書区分
総括
研究課題名
精子幹細胞を用いた創薬モデルラット作成技術の開発
課題番号
H21-生物資源・一般-002
研究年度
平成22(2010)年度
研究代表者(所属機関)
篠原 美都(京都大学大学院 医学研究科・遺伝医学講座・分子遺伝学教室)
研究分担者(所属機関)
- 高島 誠司(京都大学大学院 医学研究科・遺伝医学講座・分子遺伝学)
研究区分
厚生労働科学研究費補助金 厚生科学基盤研究分野 創薬基盤推進研究（創薬総合推進研究）
研究開始年度
平成21(2009)年度
研究終了予定年度
平成23(2011)年度
研究費
9,500,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
本研究ではES細胞でなく、精子幹細胞に基づく新しいノックアウト技術による創薬モデルラット作成技術の開発を目的としている。ラットの精子幹細胞に遺伝子トラップとジーンターゲッティングにより遺伝子改変し、ホモ変異個体を作成する技術の確立を目指す。
研究方法
研究代表者らは精子幹細胞を試験管内で長期に増殖維持する培養系を開発し、これをGermline Stem (GS)細胞と命名した。本研究ではラットのGS細胞に遺伝子操作を行い、ノックアウトラットの作成を目指した。平成２２年度の研究では、ラットGS細胞の培養条件の改善や、遺伝子導入・薬剤選択効率の改善を行うとともに、長期培養が精子幹細胞の機能的活性に及ぼす影響を調べた。また遺伝的背景が精子幹細胞の増殖や遺伝子導入・薬剤選択の効率に及ぼす影響を調べた。ジーンターゲッティングについてはOccludin遺伝子のノックアウトベクターをGS細胞に導入して、相同組み換え体を作成し、ヌードマウス精巣に移植を行った。
結果と考察
これまでの方法ではGS細胞の薬剤選択における培養条件が不十分なため、複数遺伝子が挿入されたクローンのみが選択的に樹立されるという問題があった。培養液の組成の改変（B27 supplement, 血清濃度の変更、低酸素下培養など）により、single integration clone の樹立が可能な培養条件を確立するとともに、長期培養や薬剤選択によるGS細胞の安定性や子孫作性能などを検討した。遺伝子ターゲティングによるノックアウトラットの作成については、ラット由来のノックアウトベター（Lesch-Nyhan病の原因遺伝子であるHprt、癌抑制遺伝子p53、接着因子occludinの破壊ベクター）を作成し、 ラットＧＳ細胞へ導入し、薬剤選択によりHprt遺伝子につき44個、 Occludin遺伝子にて146個のクローンを樹立したうち、Occludin遺伝子にて２個の相同組み換えクローンを同定した。ヌードマウスおよびラットのレシピエント精巣に移植を行ったところ、コロニー形成が認められた。またラット精巣細胞はマウスに比べ、フィーダー細胞や血清がＧＳ細胞の維持に悪影響を及ぼす可能性があることから、新規無血清培地を開発し、マウスにて無血清・フィーダーフリー培養に成功した。
結論
上記の改善点を取り入れ、平成２３年度の研究ではノックアウト個体の作成を目指す。
公開日・更新日
公開日
2011-05-25
更新日
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