非メジャー血清群腸管出血性大腸菌の重症化因子の同定及び新たな分離検出法確立のための研究

文献情報

• 文献番号: 202423003A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: 非メジャー血清群腸管出血性大腸菌の重症化因子の同定及び新たな分離検出法確立のための研究
• 研究課題名（英字）: -
• 課題番号: 22KA3001
• 研究年度: 令和6(2024)年度
• 研究代表者(所属機関): 窪村 亜希子(国立感染症研究所 細菌第一部)

研究分担者(所属機関)

• 李　謙一(国立感染症研究所　細菌第一部)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 健康安全確保総合研究分野 食品の安全確保推進研究
• 研究開始年度: 令和4(2022)年度
• 研究終了予定年度: 令和6(2024)年度
• 研究費: 3,000,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

腸管出血性大腸菌（enterohemorrhagic Escherichia coli: EHEC）は食中毒や腸管感染症の原因微生物の１つであり、ヒトに下痢等の消化器症状を発症させる。分離されるEHECの90%以上は、主要7血清群（O157等）であるため、EHECに関する研究はそれら血清群を中心に行われてきたが、主要ではない血清群（以下、非メジャー血清群）についても重症例や死亡例が国内外で報告されていることから着目していく必要性がある。非メジャー血清群EHECは、病原性遺伝子領域（locus of enterocyte effacement: LEE）を保有しない血清群（LEE(-)血清群）と、保有するが主要ではない血清群（LEE(+)マイナー血清群）に分類される。本研究では、昨年度取得したLEE(+)マイナー血清群EHECの全ゲノム配列(whole-genome sequence: WGS) 解析に加え、LEE(-)血清群EHECのkatNの解析および未特定の細胞付着因子の特定を試みる。さらに、非メジャー血清群EHECについて既存培地による分離検出の有用性についても評価を行う。

研究方法

LEE(+)マイナー血清群EHECのうち、溶血性尿毒症症候群（HUS）発症例由来株が含まれる7種類のO血清（O51, O70, O76, O80, O109, O172, O177）に属する株のWGS解析を行い、Multilocus sequence typing（MLST）によるST特定、SNP抽出による系統解析、および網羅的な病原性関連遺伝子検出を行った。さらに検出された遺伝子保有状況を比較することで重症例から有意に高率に検出される遺伝子を特定した。LEE(-)血清群EHECについては、昨年度の解析により重症例から高率に検出されたkatNについて、マクロファージ細胞を用いた解析、各血清型大腸菌のkatN保有状況調査、およびkatN検出系の開発も行った。さらに死亡例由来LEE(-)血清群EHECから検出されるHEp-2細胞付着性に寄与する未特定の細胞付着因子をTn-seq解析法により特定を行った。また、非メジャー血清群EHECのうち国内で多く分離される8種類の血清型（64株）のEHECについて、セフィキシム・亜テルル酸カリウム（CT）含有または不含の既存平板培地における発育状況等の確認により各培地による分離検出の有用性について評価を行った。

結果と考察

LEE(+)マイナー血清群EHECについてWGS解析により病原遺伝子を網羅的に検出することで、重症例由来株からkatP等の特定の遺伝子が高率に検出されることを特定した。また、katPおよびkatNの遺伝子保有状況を確認することで、いずれも重症率の高いO血清群または血清型において保有が確認されたことから、これらの抗酸化に関与する因子は特定の血清型の非メジャー血清群EHECにおいて重症化に寄与している可能性が示唆された。死亡例由来EHEC株の新規細胞付着因子特定においては、Tn-seq解析および追加の解析により、培養細胞への付着性は本菌の外膜タンパクが担っていることを明かにした。既存培地への発育状況による分離検出の有用性評価では、非メジャー血清群EHECの半数以上がCT含有培地において発育が困難であることが確認された。非メジャー血清群を含む多様な血清型のEHECに有用な分離検出法を確立することは重要な課題であり、そのためにはCT以外の選択剤等に着目して有用性を評価していく必要性があると考えられた。

結論

多様な血清型のEHECに有用な分離検出法の確立にはCT以外にも着目して有用性を評価することが重要である。酸化ストレスに対する防御機能に関与する因子および外膜タンパク遺伝子は特定の血清型のEHEC感染症の重症化に関与している可能性がある。

公開日・更新日

• 公開日: 2025-08-07
• 更新日: -

文献情報

• 文献番号: 202423003B
• 報告書区分: 総合
• 研究課題名: 非メジャー血清群腸管出血性大腸菌の重症化因子の同定及び新たな分離検出法確立のための研究
• 研究課題名（英字）: -
• 課題番号: 22KA3001
• 研究年度: 令和6(2024)年度
• 研究代表者(所属機関): 窪村 亜希子(国立感染症研究所 細菌第一部)

研究分担者(所属機関)

• 李　謙一(国立感染症研究所　細菌第一部)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 健康安全確保総合研究分野 食品の安全確保推進研究
• 研究開始年度: 令和4(2022)年度
• 研究終了予定年度: 令和6(2024)年度
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

腸管出血性大腸菌（enterohemorrhagic Escherichia coli: EHEC）は食中毒や腸管感染症の原因微生物の１つであり、ヒトに下痢等の消化器症状を発症させる。分離されるEHECの90%以上は、主要7血清群（O157等）であるため、EHECに関する研究はそれら血清群を中心に行われてきたが、主要ではない血清群（以下、非メジャー血清群）についても重症例や死亡例が国内外で報告されていることから着目していく必要性がある。非メジャー血清群EHECは、病原性遺伝子領域（locus of enterocyte effacement: LEE）を保有しない血清群（LEE(-)血清群）と、保有するが主要ではない血清群（LEE(+)マイナー血清群）に分類される。本研究では、過去15年間に国内で分離された非メジャー血清群EHECをLEE(-)血清群およびLEE(+)マイナー血清群に分類し、全ゲノム配列(whole-genome sequence: WGS)解析や培養細胞を用いた解析により重症化因子特定を試みる。さらに既存培地による分離検出の有用性について評価も行う。

研究方法

2007-2021年に国内で分離された非メジャー血清群EHECのうち溶血性尿毒症症候群（HUS）症例由来株が含まれるO血清群である約400株のEHECを対象にWGSの取得を行うことで系統解析やゲノム解析による網羅的な病原性関連遺伝子の検出により重症例と関連する遺伝子の特定、および培養細胞への感染試験も全株を対象に実施した。さらに国内分離株数の多い8種類の血清型各8株（合計64株）を対象として10種類の既存平板培地を用いた分離検出の有用性についても評価を行った。また、LEE(-)血清群EHECにおいては、HUS症例由来株の完全長ゲノム配列の取得、重症例から高率に検出された遺伝子のうちkatNに着目をした解析と検出系の開発、および死亡例由来EHEC株から検出された細胞付着性について細胞付着因子特定のためプラスミドの解析とTn-seq解析も行った。

結果と考察

LEE(-)血清群EHECについては、WGS解析により重症例由来株からcdiAB, gad, katN, rgdR, stx2が高率に検出された。さらに、HUS症例由来株については完全長ゲノム配列の取得と解析を行ったことで、いずれも巨大プラスミドを保有していることが確認された。培養細胞への感染試験結果から、細胞への付着率や付着形態はLEEを保有する主要な血清群のEHECとは異なることが明らかとなった。さらに、死亡例由来LEE(-)血清群EHEC株の培養細胞への付着性は本菌の外膜タンパクが担っていることも明らかとなった。
LEE(+)マイナー血清群EHECについては11株のHUS症例由来株から共通してstx2が検出され、非メジャー血清群EHECにおいてもstx2が重症化に寄与している可能性が示唆された。さらに、全株を対象としたゲノム解析により重症例由来株からkatP等の遺伝子が高率に検出されることを特定した。katPおよびkatNの遺伝子保有率の調査により、いずれも重症率の高いO血清群または血清型において保有が確認されたことから、抗酸化に関与する因子は特定の血清型の非メジャー血清群EHECにおいて重症化に寄与している可能性が示唆された。さらに、非メジャー血清群EHECの半数以上がCT含有培地において発育が困難であることも確認され、今後CT以外の選択剤等にも着目して有用性を評価していく必要性があると考えられた。

結論

非メジャー血清群EHECにおいてもstx2が重症化に寄与している可能性が示唆された。stx2以外では、酸化ストレスに対する防御機能に関与する因子および外膜タンパクによる細胞付着性が特定の血清型のEHEC感染症において重症化に関与していることが示唆された。また、多様な血清型のEHECに有用な分離検出法の確立は重要であり、そのためにはCT以外の選択剤等に着目してその有用性を評価していく必要性があると考えられた。

公開日・更新日

• 公開日: 2025-08-07
• 更新日: -

行政効果報告

• 文献番号: 202423003C

成果

• 専門的・学術的観点からの成果: 抗酸化に関与する因子が複数の特定の血清型の腸管出血性大腸菌（EHEC）において重症化に寄与している可能性が示唆された。本因子が重症化に寄与していることを特定するには引き続き解析が必要になるが、EHECの重症化因子が特定されればEHEC感染症の治療薬等開発の一助となる。
• 臨床的観点からの成果: 該当なし。
• ガイドライン等の開発: 該当なし。
• その他行政的観点からの成果: 主要な7つのO血清群（O157等）以外のO血清群のEHECのうち国内分離株数が多い8つの血清型（64株）の半数以上がEHECの分離に用いられる選択剤であるセフィキシム・亜テルル酸カリウム（CT）含有培地における発育が困難であることを明かにした。それにより、食中毒等の事例発生時において食品等検体からEHECの分離を行う場合は、CT不含培地の確認も併せて行うことが多様な血清型のEHECの分離検出には重要であることが示され、多様な血清型のEHECの分離検出向上は食品の安全確保に繋がる。
• その他のインパクト: 該当なし。

発表件数

• 原著論文（和文）: 0件
• 原著論文（英文等）: 1件
• その他論文(和文): 0件
• その他論文(英文等): 0件
• 学会発表(国内学会): 3件
• 学会発表(国際学会等): 0件
• その他成果(特許の出願): 0件
• その他成果(特許の取得): 0件
• その他成果(施策への反映): 0件
• その他成果(普及・啓発活動): 0件

主な原著論文20編（論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限る）

• 原著論文1: Akiko Kubomura, Kenichi Lee, et al.; Complete genome sequence of eight LEE-negative Shiga toxin-producing Escherichia coli strains isolated from patients with hemolytic-uremic syndrome; Microbiology Resource Announcements (2024); https://doi.org/10.1128/mra.00591-23

公開日・更新日

• 公開日: 2025-06-20
• 更新日: -

収支報告書

• 文献番号: 202423003Z
• 報告年月日: 2025年04月25日

収入

• (1)補助金交付額: 3,000,000円
• (2)補助金確定額: 3,000,000円
• 差引額 [(1)-(2)]: 0円

支出

研究費 (内訳)	直接研究費	物品費	2,176,560円
		人件費・謝金	519,840円
		旅費	0円
		その他	303,600円
	間接経費		0円
合計			3,000,000円

備考

• 備考: -

公開日・更新日

• 公開日: 2025-08-26
• 更新日: -