文献情報
文献番号
199700707A
報告書区分
総括
研究課題名
福山型先天性筋ジストロフィーの病態解明に関する研究
課題番号
-
研究年度
平成9(1997)年度
研究代表者(所属機関)
戸田 達史(東京大学医科学研究所)
研究分担者(所属機関)
- 片山榮作(東京大学医科学研究所)
- 埜中征哉(国立精神・神経センター武蔵病院)
- 堀江正人(大塚製薬株式会社大塚GEN研究所)
研究区分
厚生科学研究費補助金 先端的厚生科学研究分野 脳科学研究事業
研究開始年度
平成9(1997)年度
研究終了予定年度
平成11(1999)年度
研究費
70,000,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
福山型先天性筋ジストロフィ-(FCMD) は、福山によって報告・確立された先天性筋 ジ ストロフィ-の一型であり、重度の筋ジストロフィ-に脳奇形を伴う常染色体劣性遺伝性神経筋疾患である。その頻度は我が国の筋ジストロフィ-の中ではデュシャンヌ型に次いで多く我々の約80人に1人が保因者である。患児は生涯歩行不能であり、同時に精神発達遅延を伴い、多くは20歳以前に死亡する難病である。また 、本症の脳病変は神経細胞遊走障害による脳奇形と考えられ、本症の原因遺伝子産物は脳で働く未知の機能分子である。我々は本症原因遺伝子が第9番染色体長腕31領域に存在することを初めて見い出した。さらに我々はポジショナルクローニング法により、遺伝子の同定を行った。本研究では、さらに進めて抗体作成、生化学的解析、形態学的解析、ノックアウトマウス、結合蛋白など遺伝子産物の局在・機能解析を行い、本症の骨格筋の病態や 脳細胞の遊走の機構について 解 明 し、治療法を確立することを目的とする。
研究方法
(1) 福山型先天性筋ジストロフィ-原因遺伝子
我々は病気の創始者は1人でありそれが全国に広がったこと、FCMD患者の95%以上が予想領域にDNA insertionを持つことを報告してきた。このinsertionプローブをもとにcDNAライブラリーから得られた候補cDNAにおいて、患者における変異を発見し、福山型遺伝子を同定し、遺伝子産物をフクチンと命名した。FCMDcDNAは7349bp、フクチンは461アミノ酸からなり、既知の蛋白と相同性を認めない機能未知の新規蛋白である。FCMDはレトロトランスポゾンの挿入が遠い祖先から伝わった疾患であった。
(2) 福山型先天性筋ジストロフィ-遺伝子のゲノム構造の解析
cDNAの塩基配列が遺伝子領域のコスミドコンティグのどこに存在するかを検討し、対応するコスミドの塩基配列を読むことにより、FCMD遺伝子のエキソン、イントロンを決定した。結果、FCMD遺伝子はゲノム上の約100kbの領域にまたがり、そのcDNAは10個のエクソンからなっていた。
(3)フクチン抗体の作成の試み
FCMD遺伝子産物フクチンの推定アミノ配列より、ペプチド鎖を6種作成し、またフクチンのそれぞれ全長、N末端、C末端を有するGST融合蛋白を作成した。これらを免疫しポリクローナル、モノクローナル抗体の作成を多種試みたが、FCMDならびに正常筋で特異的に反応するものは未だ得られていない。
(4)マウスFCMD遺伝子の単離
ノックアウトマウス作製に必要とされる遺伝子ターゲッティングベクターを構築するため、福山型筋ジストロフィー原因遺伝子FCMDのマウスホモローグに対応する染色体DNAクローンを単離した。この染色体DNAクローンを解析し、エクソン-イントロン構造の決定と、詳細な制限酵素地図の作成を行った。またマウスFcmd遺伝子のcDNAを単離し、その塩基配列を決定するとともに、組み換え蛋白質の発現ベクターを構築し、抗体作製に用いるマウス組み換え蛋白質を作製した。
(5)福山型先天性筋ジストロフィーの臨床、病理学的解析
福山型先天性筋ジストロフィーでは病初期から強い線維化があり、筋の再生プロセスの欠陥が推定されている。まずラット骨格筋での再生実験で、筋の再生時に筋の発生と同じ遺伝子制御があるかどうかを確認し得た。さらにFCMD生検筋の壊死、再生のプロセスを解明するため、未熟で未分化な再生筋線維に筋発生の分化誘導遺伝子であるmyoD、myogenin発現の有無を免疫組織化学的に検討したところ、両遺伝子は確実に発現しており、FCMDでの再生遅延には別の因子の関与が推定された。
(6)遺伝子産物の超微形態解析
福山型筋ジストロフィーの原因遺伝子産物の急速凍結ディープエッチ・レプリカ電子顕微鏡法による高分解能構造解析を行うため、レプリカ像からその3次元構造を再構成する手法を開発し、筋肉ミオシン頭部などへの応用を試みた。技術改良を重ねることにより、ほぼ目標を達成できる見込みがついた。
我々は病気の創始者は1人でありそれが全国に広がったこと、FCMD患者の95%以上が予想領域にDNA insertionを持つことを報告してきた。このinsertionプローブをもとにcDNAライブラリーから得られた候補cDNAにおいて、患者における変異を発見し、福山型遺伝子を同定し、遺伝子産物をフクチンと命名した。FCMDcDNAは7349bp、フクチンは461アミノ酸からなり、既知の蛋白と相同性を認めない機能未知の新規蛋白である。FCMDはレトロトランスポゾンの挿入が遠い祖先から伝わった疾患であった。
(2) 福山型先天性筋ジストロフィ-遺伝子のゲノム構造の解析
cDNAの塩基配列が遺伝子領域のコスミドコンティグのどこに存在するかを検討し、対応するコスミドの塩基配列を読むことにより、FCMD遺伝子のエキソン、イントロンを決定した。結果、FCMD遺伝子はゲノム上の約100kbの領域にまたがり、そのcDNAは10個のエクソンからなっていた。
(3)フクチン抗体の作成の試み
FCMD遺伝子産物フクチンの推定アミノ配列より、ペプチド鎖を6種作成し、またフクチンのそれぞれ全長、N末端、C末端を有するGST融合蛋白を作成した。これらを免疫しポリクローナル、モノクローナル抗体の作成を多種試みたが、FCMDならびに正常筋で特異的に反応するものは未だ得られていない。
(4)マウスFCMD遺伝子の単離
ノックアウトマウス作製に必要とされる遺伝子ターゲッティングベクターを構築するため、福山型筋ジストロフィー原因遺伝子FCMDのマウスホモローグに対応する染色体DNAクローンを単離した。この染色体DNAクローンを解析し、エクソン-イントロン構造の決定と、詳細な制限酵素地図の作成を行った。またマウスFcmd遺伝子のcDNAを単離し、その塩基配列を決定するとともに、組み換え蛋白質の発現ベクターを構築し、抗体作製に用いるマウス組み換え蛋白質を作製した。
(5)福山型先天性筋ジストロフィーの臨床、病理学的解析
福山型先天性筋ジストロフィーでは病初期から強い線維化があり、筋の再生プロセスの欠陥が推定されている。まずラット骨格筋での再生実験で、筋の再生時に筋の発生と同じ遺伝子制御があるかどうかを確認し得た。さらにFCMD生検筋の壊死、再生のプロセスを解明するため、未熟で未分化な再生筋線維に筋発生の分化誘導遺伝子であるmyoD、myogenin発現の有無を免疫組織化学的に検討したところ、両遺伝子は確実に発現しており、FCMDでの再生遅延には別の因子の関与が推定された。
(6)遺伝子産物の超微形態解析
福山型筋ジストロフィーの原因遺伝子産物の急速凍結ディープエッチ・レプリカ電子顕微鏡法による高分解能構造解析を行うため、レプリカ像からその3次元構造を再構成する手法を開発し、筋肉ミオシン頭部などへの応用を試みた。技術改良を重ねることにより、ほぼ目標を達成できる見込みがついた。
結果と考察
以上を総合してこの新しいcDNAはFCMD原因遺伝子であると結論した。FCMDはretrotransposal mechanismによって挿入されたタンデム配列が遠い祖先から伝わった最初の疾患である。FCMD遺伝子の発見は、筋ジストロフィーの病態解明、治療法の開発だけでなく、脳の発生の理解にも貴重な一歩となることは明らかである。特異抗体が多くの努力にもかかわらずなかなか得られないことは、フクチンは筋蛋白の中で非常に微量かまたは特異な状態(例えば分泌型)で存在している可能性が考えられた。この成否が他の機能解析にも大きな影響を及ぼすので、あらゆる手を駆使しなければならない。さらに今回単離したマウスFcmdの染色体クローン中には、翻訳開始コドンを含むエクソンが存在しており、このエクソンを相同組み換えにより欠損させるようなターゲティングベクターを構築することで、Fcmd蛋白質の発現が完全に欠損したマウスを作製することが可能と考えられる。ところで筋分化誘導遺伝子(MyoD, myogenin)の発現は筋の再生時にも発現する。筋衛星細胞の分裂、増殖にはMyoDが筋衛星細胞が融合して筋管細胞を形成する時期にはmyogeninが発現し、筋発生の時の筋芽細胞の動向と一致した。さらに筋ジストロフィー筋でも両遺伝の発現があり、筋分化誘導遺伝子の欠陥による再生遅延はないと考えられた。筋ジストロフィー筋ではなぜ再生が遅延するか別の要因を考えなければならない。また微細形態解析において、片山らが用いた試験材料の3次元像では、既に他の方法では到底得られない貴重な構造変化の情報が得られている。この手法を用いれば、溶液内あるいは細胞内の1分子のin situでの構造を解析することが可能となる。
結論
福山型先天性筋ジストロフィ-原因遺伝子が特定され、またその機能解析、病態解明に向けての道が開き出した。
公開日・更新日
公開日
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更新日
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