文献情報
文献番号
202325004A
報告書区分
総括
研究課題名
化学物質誘導性の甲状腺機能低下症における次世代影響評価に関する総合研究
課題番号
21KD1004
研究年度
令和5(2023)年度
研究代表者(所属機関)
中西 剛(岐阜薬科大学 薬学部)
研究分担者(所属機関)
- 諫田 泰成(国立医薬品食品衛生研究所 薬理部)
- 田熊 一敞(大阪大学 大学院 歯学研究科 薬理学教室)
- 松丸 大輔(岐阜薬科大学 衛生学研究室)
- 村嶋 亜紀(岐阜薬科大学 薬理学研究室)
研究区分
厚生労働科学研究費補助金 健康安全確保総合研究分野 化学物質リスク研究
研究開始年度
令和3(2021)年度
研究終了予定年度
令和5(2023)年度
研究費
18,225,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
妊娠期の甲状腺機能低下が児の脳発達に悪影響を与えることが疫学調査により明らかとなったことから、甲状腺機能低下を誘導する化学物質の次世代影響が懸念されている。しかしガイドライン試験に追加された甲状腺関連指標の変動と児動物における毒性学的意義については不明な点が数多い。追加された妊娠期の甲状腺機能関連指標の変動をリスク評価に生かすためには、発達神経毒性（DNT）評価等の次世代影響を効果的に進めるための新たな技術を導入し、母体の甲状腺機能関連指標の変動と毒性との関係を明確にする必要がある。
これまでに本研究では、児の脳発達状態を非侵襲的にトレースできるレポータートランスジェニックマウス（Syn-Repマウス）を用いて、妊娠期から甲状腺機能低下を誘導した際の次世代影響について検討を行ってきた。昨年度までにSyn-RepマウスのDNT評価におけるNew Approach Methodology（NAM）としての有用性を検証するとともに、抗甲状腺薬プロピルチオウラシル（PTU）を用いた甲状腺機能低下マウスモデルの作成条件を確定した。またSyn-Repマウスは、PTUで誘導された甲状腺機能低下によるDNTを検出できる可能性を見出した。
今年度はPTUの投与量を、甲状腺関連指標に影響が認められ始める閾値用量（10 ppm）と明確な血中甲状腺関連ホルモンの変動が認められる典型的用量（250 ppm）の２用量に設定し、これらの条件で母動物に曝露させた際の児動物の脳発達状態と各種行動への影響をガイドライン試験に準じて検討した。また昨年度に引き続きSyn-RepマウスのDNT評価におけるNAMとしての有用性を検証するために、バルプロ酸（VPA）やPTUとは作用機構が異なるDNT陽性対照物質と考えられる鉛（Pb）曝露時の応答性についても検討した。これに加えて、甲状腺ホルモンシグナルかく乱をすることが懸念されている他の化学物質の次世代影響についても検討を行うために、代替ビスフェノールであるfluorene-9-bisphenol（BHPF）についてマウスを用いた出生前発生毒性試験（TG414）を実施した。さらに甲状腺関連指標の変動による次世代影響を評価できるin vitro試験法を構築するために、ヒトiPS細胞を用いて甲状腺機能低下時に誘導される神経分化阻害のマーカー分子の抽出を行った。
これまでに本研究では、児の脳発達状態を非侵襲的にトレースできるレポータートランスジェニックマウス（Syn-Repマウス）を用いて、妊娠期から甲状腺機能低下を誘導した際の次世代影響について検討を行ってきた。昨年度までにSyn-RepマウスのDNT評価におけるNew Approach Methodology（NAM）としての有用性を検証するとともに、抗甲状腺薬プロピルチオウラシル（PTU）を用いた甲状腺機能低下マウスモデルの作成条件を確定した。またSyn-Repマウスは、PTUで誘導された甲状腺機能低下によるDNTを検出できる可能性を見出した。
今年度はPTUの投与量を、甲状腺関連指標に影響が認められ始める閾値用量（10 ppm）と明確な血中甲状腺関連ホルモンの変動が認められる典型的用量（250 ppm）の２用量に設定し、これらの条件で母動物に曝露させた際の児動物の脳発達状態と各種行動への影響をガイドライン試験に準じて検討した。また昨年度に引き続きSyn-RepマウスのDNT評価におけるNAMとしての有用性を検証するために、バルプロ酸（VPA）やPTUとは作用機構が異なるDNT陽性対照物質と考えられる鉛（Pb）曝露時の応答性についても検討した。これに加えて、甲状腺ホルモンシグナルかく乱をすることが懸念されている他の化学物質の次世代影響についても検討を行うために、代替ビスフェノールであるfluorene-9-bisphenol（BHPF）についてマウスを用いた出生前発生毒性試験（TG414）を実施した。さらに甲状腺関連指標の変動による次世代影響を評価できるin vitro試験法を構築するために、ヒトiPS細胞を用いて甲状腺機能低下時に誘導される神経分化阻害のマーカー分子の抽出を行った。
研究方法
被験物質の投与は、DNT試験（TG426）のスケジュールに準じて妊娠６日から行った。
DNT研究におけるSyn-Repマウスの有用性の検証には、酢酸鉛を飲水投与して行った。甲状腺機能低下の誘導は、プロピルチオウラシル（PTU）を混餌投与することで行った。
その後の児動物の脳について、in vivoイメージング解析とNissl染色法等による組織形態学的解析を行った。また胎生期にPTUに曝露した児動物を対象に、自発行動試験や社会性相互作用試験等の各種行動試験を行った。
BHPFの胎児の発生や器官／骨格形成に対する影響の評価は、出生前発生毒性試験（TG414）に準じた方法で行った。BHPFは溶媒に溶解したものを強制経口投与して曝露した。
ヒトiPS細胞における甲状腺ホルモン受容体（THR）αのノックダウン（KD）はshRNAを搭載したレンチウイルスベクターを感染させることで行った。作製した細胞についてRNA抽出を行い、scramble controlに対して発現が低下している遺伝子の網羅的解析を行った。
DNT研究におけるSyn-Repマウスの有用性の検証には、酢酸鉛を飲水投与して行った。甲状腺機能低下の誘導は、プロピルチオウラシル（PTU）を混餌投与することで行った。
その後の児動物の脳について、in vivoイメージング解析とNissl染色法等による組織形態学的解析を行った。また胎生期にPTUに曝露した児動物を対象に、自発行動試験や社会性相互作用試験等の各種行動試験を行った。
BHPFの胎児の発生や器官／骨格形成に対する影響の評価は、出生前発生毒性試験（TG414）に準じた方法で行った。BHPFは溶媒に溶解したものを強制経口投与して曝露した。
ヒトiPS細胞における甲状腺ホルモン受容体（THR）αのノックダウン（KD）はshRNAを搭載したレンチウイルスベクターを感染させることで行った。作製した細胞についてRNA抽出を行い、scramble controlに対して発現が低下している遺伝子の網羅的解析を行った。
結果と考察
今年度は以下のことを明かにした。
1) Syn-Repマウスは、VPAやPTUとは異なった作用機構のDNT陽性対照物質の影響も検出できる可能性が明らかとなり、NAMとしての有用性が示された。
2) 妊娠期～離乳期の甲状腺機能低下においては、児動物大脳皮質の神経細胞数に影響は認められなかったが、アストロサイト数の増加が観察された。またSyn-Repマウスはアストロサイトの活性化を伴う脳発達への影響も評価できる可能性が示された。
3) 妊娠期～離乳期に甲状腺機能が低下すると、雄性児動物に多動などの情動行動の異常が誘導される可能性が示された。またこの影響は、母動物の甲状腺関連指標に変動が認められる閾値付近のPTU用量においても認められた。
4) 妊娠期のBHPF曝露は母体甲状腺機能や児動物の器官形成および骨格形成には影響を与えないことが明らかとなった。
5) ヒトiPS細胞を用いた甲状腺機能低下モデルにおいて、化合物の発達神経毒性を評価できるバイオマーカーとしてFactor Xを抽出した。
1) Syn-Repマウスは、VPAやPTUとは異なった作用機構のDNT陽性対照物質の影響も検出できる可能性が明らかとなり、NAMとしての有用性が示された。
2) 妊娠期～離乳期の甲状腺機能低下においては、児動物大脳皮質の神経細胞数に影響は認められなかったが、アストロサイト数の増加が観察された。またSyn-Repマウスはアストロサイトの活性化を伴う脳発達への影響も評価できる可能性が示された。
3) 妊娠期～離乳期に甲状腺機能が低下すると、雄性児動物に多動などの情動行動の異常が誘導される可能性が示された。またこの影響は、母動物の甲状腺関連指標に変動が認められる閾値付近のPTU用量においても認められた。
4) 妊娠期のBHPF曝露は母体甲状腺機能や児動物の器官形成および骨格形成には影響を与えないことが明らかとなった。
5) ヒトiPS細胞を用いた甲状腺機能低下モデルにおいて、化合物の発達神経毒性を評価できるバイオマーカーとしてFactor Xを抽出した。
結論
Syn-RepマウスおよびヒトiPS細胞を用いたin vitro系を組む合わせることで、妊娠期の甲状腺機能低下時やDNT陽性対照物質の脳神経系構築への影響評価やメカニズム解明を効果的に行うことができる可能性が示された。
公開日・更新日
公開日
2024-10-03
更新日
-