抗ウイルス作用をもつ宿主防御因子ＡＰＯＢＥＣ３Ｇと ＨＩＶ－１ Ｖｉｆとの結合領域および特性の解明と、その阻害化合物の検索

文献情報

• 文献番号: 200932038A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: 抗ウイルス作用をもつ宿主防御因子ＡＰＯＢＥＣ３Ｇと ＨＩＶ－１ Ｖｉｆとの結合領域および特性の解明と、その阻害化合物の検索
• 課題番号: H19-エイズ・若手-002
• 研究年度: 平成21(2009)年度
• 研究代表者(所属機関): 武田 哲(国立感染症研究所 エイズ研究センター)
• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 エイズ対策研究
• 研究開始年度: 平成19(2007)年度
• 研究終了予定年度: 平成21(2009)年度
• 研究費: 1,700,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

HIV-1感染治療において、多剤併用療法の定着が感染予後の改善に大きな成果を挙げているが、作用機序が既存のメカニズムと異なる新規抗HIV薬の開発を強力に推進することは非常に重要であると考えられる。
本研究では、宿主のA3Gの生体防御機構を活用した新たな機序による抗HIV-1薬剤を開発するための基礎研究を行う。

研究方法

（１）野生型A3Gと変異型A3G (D128K)タンパク、Vif (GSTタグつき)タンパクの３種を発現し精製した。一方、A3G の抗ウサギ血清を作製し精製を行った。精製した抗 A3G 抗体を固層化し、ELISA系を作製した。A3Gに結合したVifの検出は、HRP conjugated 抗GST抗体を用いて定量化した。
（２）細胞を用いたVif阻害剤をスクリーニングする系を作製した。A3Gを安定発現する細胞クローンを作製し、さらにvif遺伝子を導入して両タンパクを発現する細胞株を作製した。Vifの発現に関してはTet-Off を用い、安定クローンの選別中は ドキシサイクリン(Dox)を添加しVifの発現を抑制した。
（３）遺伝子組換えレンチウイルスを用い、iPS細胞に変異型A3Gを導入する。変異型A3Gを発現するiPS細胞を作製し、in vivoおよびin vitroでリンパ球等に分化させ、HIV-1に対して抵抗性を獲得するか確認する。

結果と考察

（１）結合を阻害する化合物が存在する場合、A3G/GST-Vif複合体形成が阻害され化学発光量の減少が認められるという系を確立した。
（２）細胞クローン樹立中に添加していたDoxを除くことにより、経時的にVifの発現が上昇し、A3Gの発現の減少することがウエスタンブロットにより確認された。
（３）レンチウイルスベクターに変異型A3G、IRES配列およびpuromycin耐性遺伝子を導入した物を作製し遺伝子組換えレンチウイルスを作製した。

結論

in vitroの結合実験系に関して、使用するVifの調製ロット間の違いが問題となったことが判明した。このため、単一ロットのVifタンパク大量発現・精製の必要性が生じ、候補化合物のスクリーニング実験が遅延した。細胞ベースのスクリーニング系に関しては、独創的な系を構築することに成功した。これらの系を用いて、候補化合物を見つけ出したいと考えている。また、変異型A3Gを導入したiPS細胞のHIV-1抵抗性についても検討したいと考えている。

公開日・更新日

• 公開日: 2014-05-26
• 更新日: -

文献情報

• 文献番号: 200932038B
• 報告書区分: 総合
• 研究課題名: 抗ウイルス作用をもつ宿主防御因子ＡＰＯＢＥＣ３Ｇと ＨＩＶ－１ Ｖｉｆとの結合領域および特性の解明と、その阻害化合物の検索
• 課題番号: H19-エイズ・若手-002
• 研究年度: 平成21(2009)年度
• 研究代表者(所属機関): 武田 哲(国立感染症研究所 エイズ研究センター)
• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 エイズ対策研究
• 研究開始年度: 平成19(2007)年度
• 研究終了予定年度: 平成21(2009)年度
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

HIV-1感染治療において、多剤併用療法の定着が感染予後の改善に大きな成果を挙げているが、作用機序が既存のメカニズムと異なる新規抗HIV薬の開発を強力に推進することは非常に重要であると考えられる。
本研究では、宿主のA3Gの生体防御機構を活用した新たな機序による抗HIV-1薬剤を開発するための基礎研究を行う。

研究方法

（１）野生型A3Gと変異型A3G (D128K)タンパク、Vif (GSTタグつき)タンパクの３種を発現し精製した。A3G とVif の結合実験にはEMSAを行った。
（２）A3G の抗ウサギ血清を作製し精製を行った。精製した抗 A3G 抗体を固層化し、（１）で作製したタンパクを用いELISA系を作製した。A3Gに結合したVifの検出は、HRP conjugated 抗GST抗体を用いて定量化した。
（３）細胞を用いたVif阻害剤をスクリーニングする系を作製した。A3Gを安定発現する細胞クローンを作製し、さらにvif遺伝子を導入して両タンパクを発現する細胞株を作製した。Vifの発現に関してはTet-Off を用い、安定クローンの選別中は ドキシサイクリン(Dox)を添加しVifの発現を抑制した。
（４）遺伝子組換えレンチウイルスを用い、iPS細胞に変異型A3Gを導入する。変異型A3Gを発現するiPS細胞を作製し、in vivoおよびin vitroでリンパ球等に分化させ、HIV-1に対して抵抗性を獲得するか確認する。

結果と考察

（１）Znキレーターにより結合が阻害されたが、塩濃度、Mg濃度、pHには影響を受けなかった。
（２）結合を阻害する化合物が存在する場合、A3G/GST-Vif複合体形成が阻害され化学発光量の減少が認められるという系を確立した。
（３）細胞クローン樹立中に添加していたDoxを除くことにより、経時的にVifの発現が上昇し、A3Gの発現の減少することがウエスタンブロットにより確認された。
（４）レンチウイルスベクターに変異型A3Gを導入した物を作製し遺伝子組換えレンチウイルスを作製した。

結論

in vitroの結合実験系に関して、使用するVifの調製ロット間の違いが問題となったことが判明した。このため、単一ロットのVifタンパク大量精製の必要性が生じ、スクリーニング実験が遅延した。細胞ベースのスクリーニング系に関しては、独創的な系を構築することに成功した。これらの系を用いて、候補化合物を見つけ出したいと考えている。また、変異型A3Gを導入したiPS細胞のHIV-1抵抗性についても検討する。

公開日・更新日

• 公開日: 2014-05-26
• 更新日: -

行政効果報告

• 文献番号: 200932038C

成果

• 専門的・学術的観点からの成果: 精製A3Gタンパクを用いたin vitroでのスクリーニングの系、あるいはA3GとHIV-1 Vifタンパクをともに発現するような細胞系でのスクリーニングの系に関して、ともに独創的な系をを構築することに成功した。これらの系を用いることにより、今までとは異なった標的となる治療薬剤の開発に貢献することができると考えられる。また、学術論文などで広く公開することで情報を提供し将来の薬剤開発につなげられると期待される。
• 臨床的観点からの成果: 新規作用機序による抗 HIV 薬剤の実用化は、既存の抗 HIV 薬剤に対して多剤耐性 HIV を獲得した治療困難症例を救済することが期待される。それだけでなく、薬の選択肢を増やすため、副作用を回避できるチャンスも高くなり薬剤治療者の負担軽減が期待される。さらに、従来の抗ウイルス剤にはない、宿主の生体防御機構を活用した作用機序をもつ薬剤開発という新たな分野にも道を広げることが期待できる。今回構築した系を用いることにより新規作用機序による抗HIV薬剤の開発の第一歩を踏み出すことが可能となる。
• ガイドライン等の開発: 特になし
• その他行政的観点からの成果: 特になし
• その他のインパクト: 特になし

発表件数

• 原著論文（和文）: 0件
• 原著論文（英文等）: 0件
• その他論文(和文): 0件
• その他論文(英文等): 0件
• 学会発表(国内学会): 2件
• 学会発表(国際学会等): 0件
• その他成果(特許の出願): 0件 ; 「出願」「取得」計0件
• その他成果(特許の取得): 0件
• その他成果(施策への反映): 0件
• その他成果(普及・啓発活動): 0件

公開日・更新日

• 公開日: 2014-05-26
• 更新日: -