文献情報
文献番号
202301008A
報告書区分
総括
研究課題名
戦没者遺骨の身元特定に係るDNA鑑定の精度向上に関する研究
課題番号
21AA2004
研究年度
令和5(2023)年度
研究代表者(所属機関)
橋谷田 真樹(関西医科大学 医学部)
研究分担者(所属機関)
- 眞鍋 翔(関西医科大学 法医学講座)
- 玉木 敬二(京都大学 医学研究科)
- 中村 安孝(東京歯科大学 歯学部)
- 松末 綾(福岡大学 医学部法医学)
- 北川 美佐(大阪医科薬科大学 医学部医学科 予防・社会学講座 法医学教室)
- 山田 良広(神奈川歯科大学 歯学部 社会歯科学系 法医学講座 歯科法医学分野)
- 浅利 優(旭川医科大学 法医学講座)
研究区分
厚生労働科学研究費補助金 行政政策研究分野 政策科学総合研究（政策科学推進研究）
研究開始年度
令和3(2021)年度
研究終了予定年度
令和5(2023)年度
研究費
17,500,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
本研究では、厚生労働省の戦没者遺骨のDNA鑑定事業の効率的な遂行のために、「戦没者遺骨鑑定の標準プロトコルの作成」、「多数の遺骨・ご遺族から該当する血縁者をスクリーニングする専用ソフトウェアの開発」を行う。
研究方法
「① 戦没者遺骨鑑定の標準プロトコルの作成」については、これまでに、各分担研究者に対し、遺骨試料のDNA型鑑定方法に関するアンケートを行い、聞き取り調査を行った。その結果、脱灰および溶解を容易にするために骨試料を「骨粉」化する、または小さな「骨片」として作業を進めるといった違いが見られた。そこで、骨試料を骨粉化した後、3種の市販されているDNA抽出キットを使用してDNA抽出を行う方法と、骨片をある市販の試薬で溶解させた後、2種の市販のDNA精製キットでDNAの回収を行うという、計５通りの抽出方法について、同じ骨資料を用いて実証実験を行なった。
「② 多数の遺骨・ご遺族から該当する血縁者をスクリーニングする専用ソフトウェアの開発」については、より視認性に優れたshinyパッケージを導入した。また、計算速度の向上のため、DNA型の解析を行うプログラムはC++言語で作成した。ソフトウェアの検証のためにコンピュータ上で模擬のDNA型、つまり父-息子、母-娘、兄弟、姉妹、父方おじ-甥、母方おば-姪のなどの血縁ペアのDNA型（STR型、Y-STR型、mtDNA型）を作成した。2人のペアのうち1人を遺骨側、もう1人を遺族側に振り分け、血縁関係毎にソフトウェアで解析した。この解析結果を基に、血縁関係毎の感度および特異度を調査した。血縁関係の判定基準は、常染色体STR型における尤度比を100以上、Y-STR型の不一致を2か所以内、mtDNA型の不一致を1か所以内とした。さらに、実際のご遺骨ではDNAの状態が悪く、DNA型の一部を検出できないことがあるが、この状況を想定するために、遺骨側のDNA型の50％が不検出である場合における感度・特異度についても同様に検討した。
「② 多数の遺骨・ご遺族から該当する血縁者をスクリーニングする専用ソフトウェアの開発」については、より視認性に優れたshinyパッケージを導入した。また、計算速度の向上のため、DNA型の解析を行うプログラムはC++言語で作成した。ソフトウェアの検証のためにコンピュータ上で模擬のDNA型、つまり父-息子、母-娘、兄弟、姉妹、父方おじ-甥、母方おば-姪のなどの血縁ペアのDNA型（STR型、Y-STR型、mtDNA型）を作成した。2人のペアのうち1人を遺骨側、もう1人を遺族側に振り分け、血縁関係毎にソフトウェアで解析した。この解析結果を基に、血縁関係毎の感度および特異度を調査した。血縁関係の判定基準は、常染色体STR型における尤度比を100以上、Y-STR型の不一致を2か所以内、mtDNA型の不一致を1か所以内とした。さらに、実際のご遺骨ではDNAの状態が悪く、DNA型の一部を検出できないことがあるが、この状況を想定するために、遺骨側のDNA型の50％が不検出である場合における感度・特異度についても同様に検討した。
結果と考察
「① 戦没者遺骨鑑定の標準プロトコルの作成」については，10検体の骨試料全てにおいて５種の抽出方法を試み、それぞれ抽出したDNAを定量したところ、0.0006 ng/μl〜0.0177 ng/μlの範囲でヒトDNAが得られた。DNA量に優位差が見られるほどの違いはなく、どの方法を用いても同じような値しか得られなかった。常染色体上STR解析用の増幅試薬であるGlobalFiler PCR Amplification Kit（Thermo Fisher Scientific）を用いたSTR解析の結果、最も多くのSTR情報を得ることができたのは、骨片を脱灰した後、DNAエキストラクターFMキット(FUJIFILM)を用いて試料を溶解し、フェノール・クロロホルム処理後の上清をNucleoSpin Gel and PCR Clean-up(TaKaRa)にてDNAを抽出する方法であった。
「② 多数の遺骨・ご遺族から該当する血縁者をスクリーニングする専用ソフトウェアの開発」については，感度（真の血縁ペアを正しく血縁と判定できる確率）は，父-息子，母-娘で100％，兄弟，姉妹で約93％と高く，父方おじ-甥，母方おば-姪については遠縁のため約37％に留まった．一方，特異度（非血縁ペアを正しく非血縁と判定できる確率）はSTR型のみではなくY-STR型あるいはmtDNA型を併用することで大幅に低下し，各々の血縁関係における偽陽性数は，全100万通りのうち数例に留まることが明らかとなった．さらに、DNA型の50％が不検出である場合における感度・特異度についても検討したところ，感度は低下したが，特異度は全100万通りのうち数例から十数例に留まった．
「② 多数の遺骨・ご遺族から該当する血縁者をスクリーニングする専用ソフトウェアの開発」については，感度（真の血縁ペアを正しく血縁と判定できる確率）は，父-息子，母-娘で100％，兄弟，姉妹で約93％と高く，父方おじ-甥，母方おば-姪については遠縁のため約37％に留まった．一方，特異度（非血縁ペアを正しく非血縁と判定できる確率）はSTR型のみではなくY-STR型あるいはmtDNA型を併用することで大幅に低下し，各々の血縁関係における偽陽性数は，全100万通りのうち数例に留まることが明らかとなった．さらに、DNA型の50％が不検出である場合における感度・特異度についても検討したところ，感度は低下したが，特異度は全100万通りのうち数例から十数例に留まった．
結論
「① 戦没者遺骨鑑定の標準プロトコルの作成」については、DNA抽出の実証実験の結果，骨片を脱灰した後、DNAエキストラクターFMキット(FUJIFILM)を用いて試料を溶解し、フェノール・クロロホルム処理後の上清をNucleoSpin Gel and PCR Clean-up(TaKaRa)にてDNAを抽出する方法が最も解析成績が良かった。DNAが抽出された後の解析工程は、統一されていることから、本研究により、抽出・増幅・解析の行程は統一され、専用のプロトコルが確立されたと言って良いであろう。
「② 多数の遺骨・ご遺族から該当する血縁者をスクリーニングする専用ソフトウェアの開発」については、戦没者遺骨のDNA鑑定事業への実用化に向けて検証作業中であり，検証が完了すれば、本事業への実用化につながるものと期待される。なお、ソフトウェアはオープンソースのプログラミング言語Rで構築していることから、誰でも無料で利用できる形で公開する予定である。
「② 多数の遺骨・ご遺族から該当する血縁者をスクリーニングする専用ソフトウェアの開発」については、戦没者遺骨のDNA鑑定事業への実用化に向けて検証作業中であり，検証が完了すれば、本事業への実用化につながるものと期待される。なお、ソフトウェアはオープンソースのプログラミング言語Rで構築していることから、誰でも無料で利用できる形で公開する予定である。
公開日・更新日
公開日
2024-07-01
更新日
-