文献情報
文献番号
202224041A
報告書区分
総括
研究課題名
ヒト末梢血誘導型ミクログリア細胞技術を用いた食品の神経毒性評価システムの開発
課題番号
20KA3005
研究年度
令和4(2022)年度
研究代表者(所属機関)
扇谷 昌宏(旭川医科大学 医学部 解剖学講座機能形態学分野)
研究分担者(所属機関)
- 原口 祥典(佐賀大学 医学部精神科)
- 加藤 隆弘(九州大学医学部)
研究区分
厚生労働科学研究費補助金 健康安全確保総合研究分野 食品の安全確保推進研究
研究開始年度
令和2(2020)年度
研究終了予定年度
令和4(2022)年度
研究費
1,897,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
食品中に微量に含まれる汚染物質（金属類）が示す毒性は様々である。その中でも神経毒性は重篤であり、注意が必要である。近年、神経毒性はニューロン（神経細胞）だけでなく、周囲のミクログリアも関与していることが明らかとなり、その相互作用が特に注目されている。
一方、食品安全の分野においては未だニューロンしか研究対象にされておらず、本事業（食品の安全確保推進研究事業）においてもミクログリアに着目した研究は皆無である。
本研究は、汚染物質（金属類）のミクログリアおよびニューロンに対する影響を明らかにし、科学的根拠に基づく食品安全行政に寄与することを目的としている。
一方、食品安全の分野においては未だニューロンしか研究対象にされておらず、本事業（食品の安全確保推進研究事業）においてもミクログリアに着目した研究は皆無である。
本研究は、汚染物質（金属類）のミクログリアおよびニューロンに対する影響を明らかにし、科学的根拠に基づく食品安全行政に寄与することを目的としている。
研究方法
（１）使用細胞
ヒト由来ニューロンは、文献（Fujii H, et al., Brain Res. 1613, 59-72 (2015)）を参考に間葉系幹細胞から誘導した。
ヒト由来ミクログリアは、文献（Ohgidani M. et al., Sci Rep, 4, 4957 (2014)）を参考に、単球から誘導した。
（２）使用金属
実験に使用した金属は、カドミウム、コバルト、マンガンおよび銅の塩化物を使用した。前年度までの基礎検討で、上記4種類の金属がニューロン単独と共培養系でIC50値に比較的大きな差が認められたため使用した。
（３）ニューロンおよびミクログリアの共培養系の構築
ニューロンおよびミクログリアの共培養系は、上記で作成したニューロンおよびミクログリアを用いた。
（４）毒性評価
毒性評価は、酵素活性測定法であるWST法を用いて測定を行った。
（５）カルシウムイメージング
ミクログリアのカルシウムイメージングは、Fura2AM溶液を用いて染色し、Ratio Imagingによる細胞内カルシウム濃度測定を行った。
ヒト由来ニューロンは、文献（Fujii H, et al., Brain Res. 1613, 59-72 (2015)）を参考に間葉系幹細胞から誘導した。
ヒト由来ミクログリアは、文献（Ohgidani M. et al., Sci Rep, 4, 4957 (2014)）を参考に、単球から誘導した。
（２）使用金属
実験に使用した金属は、カドミウム、コバルト、マンガンおよび銅の塩化物を使用した。前年度までの基礎検討で、上記4種類の金属がニューロン単独と共培養系でIC50値に比較的大きな差が認められたため使用した。
（３）ニューロンおよびミクログリアの共培養系の構築
ニューロンおよびミクログリアの共培養系は、上記で作成したニューロンおよびミクログリアを用いた。
（４）毒性評価
毒性評価は、酵素活性測定法であるWST法を用いて測定を行った。
（５）カルシウムイメージング
ミクログリアのカルシウムイメージングは、Fura2AM溶液を用いて染色し、Ratio Imagingによる細胞内カルシウム濃度測定を行った。
結果と考察
（1）ヒト由来ニューロンの作成と毒性評価
ニューロン単独での毒性評価の結果、金属種によって毒性が大きく変化することが明らかとなった。金属種間での比較で興味深いのは、カドミウムに対する毒性が他の金属と比べて許容量が比較的大きいことがあげられる。
また特に重要な知見として、金属の毒性に個人差が存在していることが明らかとなった。
（2）ヒト由来ミクログリアの作成と毒性評価
ミクログリア単独での毒性評価の結果、金属種によって毒性が大きく変化することが明らかとなった。興味深い知見として、ニューロンよりも各種金属（コバルトを除く）に対する毒性感受性が圧倒的に高いことが明らかとなった。
（3）ヒト由来ニューロンおよびミクログリア共培養系の作成と毒性評価
ヒト由来ニューロンおよびミクログリアを用いた共培養系は（研究方法B-3）に記載の方法で作成した。
共培養系での毒性評価の結果、金属種によって毒性が大きく変化することが明らかとなった。加えて、それぞれの単独培養と比べて毒性が大きく異なる傾向がみられた。これらの知見は、ニューロン・ミクログリア、それぞれ単独培養のみでは十分な毒性評価を行えていない可能性を示唆しており、共培養系による評価が重要であることを示している。
一方、共培養系でみられた現象は、単にニューロンとミクログリアの毒性を平均化したという単純なものではなかった。例えば、マンガンやコバルトでは共培養系にすることでニューロン・ミクログリアの単独培養よりもIC50が増大する（毒性が低下する）という現象が起きている。またこれらの反応は金属種によって異なっている。つまり、共培養系で起きている現象は非常に複雑な相互作用による可能性も示唆された
ニューロン単独での毒性評価の結果、金属種によって毒性が大きく変化することが明らかとなった。金属種間での比較で興味深いのは、カドミウムに対する毒性が他の金属と比べて許容量が比較的大きいことがあげられる。
また特に重要な知見として、金属の毒性に個人差が存在していることが明らかとなった。
（2）ヒト由来ミクログリアの作成と毒性評価
ミクログリア単独での毒性評価の結果、金属種によって毒性が大きく変化することが明らかとなった。興味深い知見として、ニューロンよりも各種金属（コバルトを除く）に対する毒性感受性が圧倒的に高いことが明らかとなった。
（3）ヒト由来ニューロンおよびミクログリア共培養系の作成と毒性評価
ヒト由来ニューロンおよびミクログリアを用いた共培養系は（研究方法B-3）に記載の方法で作成した。
共培養系での毒性評価の結果、金属種によって毒性が大きく変化することが明らかとなった。加えて、それぞれの単独培養と比べて毒性が大きく異なる傾向がみられた。これらの知見は、ニューロン・ミクログリア、それぞれ単独培養のみでは十分な毒性評価を行えていない可能性を示唆しており、共培養系による評価が重要であることを示している。
一方、共培養系でみられた現象は、単にニューロンとミクログリアの毒性を平均化したという単純なものではなかった。例えば、マンガンやコバルトでは共培養系にすることでニューロン・ミクログリアの単独培養よりもIC50が増大する（毒性が低下する）という現象が起きている。またこれらの反応は金属種によって異なっている。つまり、共培養系で起きている現象は非常に複雑な相互作用による可能性も示唆された
結論
本年度は３年計画の最終年度であり、R2からR3年度で実施した基礎的検討を礎にヒト由来細胞での検討を行った。特に本研究では、ヒアリング時に委員の先生方から「ミクログリア＋ニューロンの評価系を目指せばより望ましい」との貴重なコメントを頂き、共培養系での評価を最終目標として研究を実施してきた。
最終年度である本年度において、最終目標であったヒト由来細胞での共培養系を構築することに成功し、共培養系が重要であることを示唆する知見を得ることができた。加えて、神経毒性に個人差が存在していることなど、副次的にも重要な知見を得ることができた。
今回、共培養系を用いて初めて明らかになった複雑な事象は、今後の研究課題として推進する必要があるが、ヒト由来細胞での共培養評価系の構築という最終目標に対しては到達できたと考えられる。
なお、今回明らかになった神経毒性に対する個人差は非常に重要であり、どの程度の差が存在するのかを、２名だけではなく複数名の規模で明らかにする必要がある。これが明らかになると日本人における神経毒性のキャパシティレンジを知ることができ、様々な政策等への利用が可能になると思われる。
最終年度である本年度において、最終目標であったヒト由来細胞での共培養系を構築することに成功し、共培養系が重要であることを示唆する知見を得ることができた。加えて、神経毒性に個人差が存在していることなど、副次的にも重要な知見を得ることができた。
今回、共培養系を用いて初めて明らかになった複雑な事象は、今後の研究課題として推進する必要があるが、ヒト由来細胞での共培養評価系の構築という最終目標に対しては到達できたと考えられる。
なお、今回明らかになった神経毒性に対する個人差は非常に重要であり、どの程度の差が存在するのかを、２名だけではなく複数名の規模で明らかにする必要がある。これが明らかになると日本人における神経毒性のキャパシティレンジを知ることができ、様々な政策等への利用が可能になると思われる。
公開日・更新日
公開日
2023-11-07
更新日
-