化学物質のインビトロ神経毒性評価法の開発

文献情報

• 文献番号: 202126003A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: 化学物質のインビトロ神経毒性評価法の開発
• 課題番号: 19KD1003
• 研究年度: 令和3(2021)年度
• 研究代表者(所属機関): 諫田 泰成(国立医薬品食品衛生研究所 薬理部)

研究分担者(所属機関)

• 斎藤　潤(京都大学　iPS細胞研究所)
• 渋谷　淳(国立大学法人東京農工大学大学院　農学研究院動物生命科学部門)
• 吉田　祥子(豊橋技術科学大学工学部)
• 吉成　浩一(静岡県立大学　薬学部)
• 鈴木　郁郎(東北工業大学　工学部)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 健康安全確保総合研究分野 化学物質リスク研究
• 研究開始年度: 令和1(2019)年度
• 研究終了予定年度: 令和3(2021)年度
• 研究費: 19,445,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

現在、発達神経毒性（DNT）は妊娠動物を用いて評価を行っている（OECD 426）。しかし、発達期の曝露と遅発性の神経毒性の関連は明確ではないため、化学物質のDNTを評価する新たな代替法試験の開発が期待される。DNT試験は多数の動物やコストがかかるため、発達過程を模倣できるヒトiPS細胞の利用が期待される。そこで本研究では、主にインビトロとインシリコによる神経毒性評価法の開発を行うとともに、OECDのガイダンス案に協力する。

研究方法

神経系の機能毒性として、iPS細胞由来神経細胞のネットワーク評価を行った。ヒトiPS神経はNeucyte社を用いて、多点電極アレイシステム (Axion BioSystems)に播種した。多点電極アレイシステムによりネットワーク機能を評価した。また、インシリコは分子記述子を利用して化学物質のクラスタリング解析を実施した。さらに、動物データが不足している化合物はin vivo評価を進めた。

結果と考察

OECDのDNT専門家会議で用いている化学物質リストから化学物質を選定し、ヒトiPS神経の神経活動を多点電極アレイシステムで記録して神経毒性の評価を行った。その結果、AcetamipridとCloathinidin（ニコチン性アセチルコリン受容体アゴニスト）、AldicarbとCarbaryl（アセチルコリンエステラーゼ阻害）、Fipronil、Dieldrin、Lindane（GABAA受容体アンタゴニスト）、Cypermethrin、Permethrin、Deltamthrin（Naチャネルのopener）は、作用機序ごとに分類できることを明らかにした。
次に、発達神経毒性をリードアクロス手法により予測する手法の構築に向けた条件検討の結果、近傍物質の定義に利用する物質間距離に閾値を設け、また近傍物質数を制限することで、リードアクロス手法による発達神経毒性の評価精度が高くなることが示唆された。
また、in vivo毒性評価を進め、28日反復投与毒性評価の枠組みでDNTが検出できることを示した。

結論

ヒトiPS細胞由来神経細胞のネットワーク活動を多点電極アレイスステムにより記録することにより、DNTが懸念される化合物の評価を行い、作用点に基づいて分類することができ、一定の予測性が得られることが示唆された。また、リードアクロス手法を用いた発達神経毒性予測手法の確立に有用な基礎的知見を得ることができ、精度の高い毒性試験データベースを整備することができた。これらの結果を利用することで、tiered approachによるDNT評価手法の開発がさらに進展することが期待される。

公開日・更新日

• 公開日: 2023-04-28
• 更新日: -

文献情報

• 文献番号: 202126003B
• 報告書区分: 総合
• 研究課題名: 化学物質のインビトロ神経毒性評価法の開発
• 課題番号: 19KD1003
• 研究年度: 令和3(2021)年度
• 研究代表者(所属機関): 諫田 泰成(国立医薬品食品衛生研究所 薬理部)

研究分担者(所属機関)

• 斎藤　潤(京都大学　iPS細胞研究所)
• 渋谷　淳(国立大学法人東京農工大学大学院　農学研究院動物生命科学部門)
• 吉田　祥子(豊橋技術科学大学工学部)
• 吉成　浩一(静岡県立大学薬学部)
• 鈴木　郁郎(東北工業大学　工学部)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 健康安全確保総合研究分野 化学物質リスク研究
• 研究開始年度: 令和1(2019)年度
• 研究終了予定年度: 令和3(2021)年度
• 研究者交替、所属機関変更: 小田原あおい氏（若手育成枠。当時、東北工業大学）が企業に就職のため、2年目からは彼女の指導教官である鈴木郁郎先生に変更となった。なお、分担研究者の変更は厚生労働省に相談し、承認済である。

研究報告書（概要版）

研究目的

これまでSystematic Literature Reviewの結果等から、特定の化学物質への胎児期の暴露量と出生児の知能指数の低下との相関関係が報告されていることなどを踏まえて、化学物質の発達神経毒性を正確に評価することは極めて重要な課題である。しかし、現行の神経毒性ガイドライン（OECD TG426）は多くの動物と費用を必要とするため、簡易かつ迅速に検出することができるin vitro試験系の開発の必要性が強く認識されてきている。そこで本研究で我々は、ヒトiPS細胞技術を活用し、インビトロ、インシリコ、インビボの観点からそれぞれ神経毒性評価を行った。

研究方法

ヒトiPS細胞株253G1は、TeSR-E8培地（Stem Cell Technologies）を用いてフィーダーフリー条件で培養した。コーティング剤にはES細胞用のマトリゲル（BD Biosciences）を用いた。ヒトiPS細胞由来神経細胞はNeucyte社を用いた。ヒトiPS細胞から分化させた中枢のGlutamatergic neuronとGABAergic neuronとヒトアストロサイトを7：3：3.5の割合で混合しMEA plateに播種した。多点電極アレイシステムにより、ネットワーク機能を評価した。インシリコは分子記述子を利用して化学物質のクラスタリング解析を実施した。胎児期および発達期のラットに、OECDのDNT専門家会議で用いている化学物質リストの中から化学物質を選定し、単回あるいは反復で投与し、出生動物の神経回路に及ぼす影響、および成長に及ぼす影響を細胞生物学的に検討した。神経毒性の評価を行った。その結果、AcetamipridとCloathinidin（ニコチン性アセチルコリン受容体アゴニスト）、AldicarbとCarbaryl（アセチルコリンエステラーゼ阻害）、Fipronil、Dieldrin、Lindane（GABAA受容体アンタゴニスト）、Cypermethrin、Permethrin、Deltamthrin（Naチャネルのopener）は、作用機序ごとに分類できることを明らかにした。また、分子記述子を利用して化学物質のクラスタリング解析を実施した結果、陽性物質及び陰性物質が高い割合で集まるグループを得ることに成功した。化学構造の類似度は高いが、DNTに関しては一致度が低いグループも存在したため、今後、in vitro試験により検証する予定である。さらに、in vivo毒性評価を進め、28日反復投与毒性評価の枠組みでDNTが検出できることを示した。

結果と考察

ヒトiPS細胞はミトコンドリアにより神経分化が誘導されることから、DNTが懸念される化学物質のミトコンドリア毒性を調べた結果、多くの化合物で毒性が検出できることが示唆された。また、ヒトiPS細胞由来神経細胞のネットワーク活動を多点電極アレイ（MEA）システムで記録して神経毒性の評価を行った。その結果、AcetamipridとCloathinidin（ニコチン性アセチルコリン受容体アゴニスト）、AldicarbとCarbaryl（アセチルコリンエステラーゼ阻害）、Fipronil、Dieldrin、Lindane（GABAA受容体アンタゴニスト）、Cypermethrin、Permethrin、Deltamthrin（Naチャネルのopener）は、作用機序ごとに分類できることを明らかにした。また、分子記述子を利用して化学物質のクラスタリング解析を実施した結果、陽性物質及び陰性物質が高い割合で集まるグループを得ることに成功した。化学構造の類似度は高いが、DNTに関しては一致度が低いグループも存在したため、今後、in vitro試験により検証する予定である。さらに、in vivo毒性評価を進め、28日反復投与毒性評価の枠組みでDNTが検出できることを示した。

結論

ヒトiPS細胞のミトコンドリア毒性によるスクリーニング法を開発した。またヒトiPS細胞由来神経細胞のネットワーク活動を多点電極アレイスステムにより記録することにより、DNTが懸念される化合物の評価を行い、作用点に基づいて分類することができ、一定の予測性が得られることが示唆された。また、リードアクロス手法を用いた発達神経毒性予測手法の確立に有用な基礎的知見を得ることができ、精度の高い毒性試験データベースを整備することができた。これらの結果を利用することで、OECDが進めているようなtiered approachによるDNT評価手法の開発に貢献できることが期待される。

公開日・更新日

• 公開日: 2023-04-28
• 更新日: -

行政効果報告

• 文献番号: 202126003C

収支報告書

• 文献番号: 202126003Z