文献情報
文献番号
202124042A
報告書区分
総括
研究課題名
食品の安全性評価の迅速化・高度化に資する造精機能障害の新規ハザード評価体系の基盤構築
課題番号
21KA3001
研究年度
令和3(2021)年度
研究代表者(所属機関)
横田 理(国立医薬品食品衛生研究所 安全性生物試験研究センター毒性部)
研究分担者(所属機関)
- 齊藤 洋克(国立医薬品食品衛生研究所 安全性生物試験研究センター 毒性部)
研究区分
厚生労働科学研究費補助金 健康安全確保総合研究分野 食品の安全確保推進研究
研究開始年度
令和3(2021)年度
研究終了予定年度
令和5(2023)年度
研究費
2,637,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
食品成分の濃縮や抽出、製剤化により、従来の食経験では安全性が担保できないことがあること、また、生理活性成分を含む食品等を過剰摂取すること、等による有害影響が危惧される。実際に、疫学調査等によりこれら過剰摂取と不妊との関連が示唆されている。しかし同時に、これらの因果関係には不明瞭な点も多く残されている。その中でも特に、ホルモン様作用を有する食品等は内分泌器官への影響が懸念されるが、生殖の有害影響はその評価特性からヒトでの把握は容易ではない。このため、食品安全行政面からヒトへの迅速な健康影響の予測性向上に資する実験動物を用いた新規ハザード評価体系の基盤構築が不可欠と考える。現在、男性不妊の主な原因である造精機能障害は、生殖細胞への直接影響とそれを支持するセルトリ細胞の障害を介した間接影響に起因する。生殖細胞の影響評価は精子濃度や運動率の測定、セルトリ細胞の影響評価は細胞数の減少で評価される。しかし、先行研究において、不妊症患者の多くは精子濃度や運動率の低下が認められないこと（臨床現場での測定方法の問題）、また、成人男性の食事を含むライフスタイルの変化等によりセルトリ細胞数が減少するような報告はなされていないことを確認しており、当該評価のみでは食品の健康影響の有用な指標にはならないこと（偽陰性）が懸念される。一方、食品摂取による影響指標として生殖細胞を支持するセルトリ細胞の機能変化が想定されるが、当該変化を検出する評価系がないことも問題点として挙げられる。これらの問題点を踏まえ、本研究では、食品安全行政面からヒトへの迅速な健康影響の予測性向上に資する実験動物を用いた新規ハザード評価体系の基盤構築を行うことを目的とした。
研究方法
私たちが先行研究で精子形成が障害されることを報告しているビタミンA過剰・欠乏、ビタミンE欠乏モデルマウス精巣をホルマリン固定し、余分な固定液を洗浄した後に脱水しパラフィン包埋ブロックを作製した。次に、ミクロトームを用い薄切切片を作製した。作製した切片は使用する抗体試薬に応じ適切な抗原賦活化処理を行った後、精子形成関連分子を認識する抗体試薬を用いた免疫組織化学染色を行った。精子は精巣上体尾部から採取し、TYH培地にてインキュベーションした後、運動評価を行なった。精子は体細胞リシス処理を行った後、RNA抽出を行った。
結果と考察
精巣毒性評価において、蛍光標識PNAレクチン抗体を用い精子細胞先体を高感度に可視化し精子stepを判別した後、精細管ステージ判定の迅速化を目指した。その結果、従来法のPAS染色と比較し、本法は精細管ステージ決定において格段に高いスループット性と解析精度を示した。これにより、ビタミンA過剰マウス精巣では野生型マウス精巣と比較して、精細管ステージⅦ,Ⅷの頻度が低下すること、対照的にステージⅡからⅥの頻度が上昇すること明らかにした。次に、本法と生殖細胞系列マーカー抗体を用いた免疫組織化学染色法とを組み合わせることで、生殖細胞系列の分化度を網羅的かつ定量的に捉えることにも成功した。その結果、ビタミンA過剰マウス精巣において、減数分裂開始に重要なプレレプトテン期精母細胞以降の細胞数の減少を認めた。一方、精上皮周期に応じて、セルトリ細胞骨格構造が変化する可能性を野生型マウス精巣組織切片の解析から見出し、この指標を新たなセルトリ細胞の機能評価として適用可能かについて、ビタミンE欠乏マウス精巣切片を用いて検証を進めている。現段階では、精細管横断面に対するvimentin陽性領域が占める面積の割合が、ビタミンE欠乏により有意に増加することが明らかとなった。
一方、界面活性剤やアルブミンフリーの生理緩衝液により精子培養液を洗浄することで、体細胞のコンタミを除去する方法を確立し、バイオマーカー探索に資する精子核酸抽出法の基盤も整備した。今後は、精巣毒性陽性対象物質の経口投与による生殖毒性評価を実施し、今年度開発した評価法の有用性を検証していく。
一方、界面活性剤やアルブミンフリーの生理緩衝液により精子培養液を洗浄することで、体細胞のコンタミを除去する方法を確立し、バイオマーカー探索に資する精子核酸抽出法の基盤も整備した。今後は、精巣毒性陽性対象物質の経口投与による生殖毒性評価を実施し、今年度開発した評価法の有用性を検証していく。
結論
本研究の遂行により、生殖毒性を早期に検出する精巣毒性評価とヒトへの外挿を考慮した非侵襲的な精子を用いた新規バイオマーカー探索に資する精子機能評価の確立を概ね達成した。次年度以降も引き続き評価系の構築と毒性陽性対象物質を用いた評価の有用性を検証していく。
公開日・更新日
公開日
2022-05-24
更新日
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