文献情報
文献番号
199700512A
報告書区分
総括
研究課題名
ヒト癌ウイルスによる発癌の分子機構と免疫系による癌細胞排除機構の解明
課題番号
-
研究年度
平成9(1997)年度
研究代表者(所属機関)
松田 道行(国立感染症研究所)
研究分担者(所属機関)
- 西連寺剛(国立感染症研究所)
- 松倉俊彦(国立感染症研究所)
- 葛西正孝(国立感染症研究所)
- 牧野正彦(国立感染症研究所)
- 山本三郎(国立感染症研究所)
研究区分
厚生科学研究費補助金 総合的プロジェクト研究分野 がん克服戦略研究事業
研究開始年度
平成9(1997)年度
研究終了予定年度
-
研究費
24,000,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
ウイルスの関与する癌は、ウイルス学的免疫学的手法により、予防および治療法の確立が可能である。従って、日本人のどの癌に、どのウイルスが、どういう役割を果たしているのかを明らかにする必要がある。特に、21世紀に向けて日本人の高齢化が進み、これらの癌を高頻度に発生する人口が増加することが予想されるので、ウイルスが関与する癌の治療、予防の研究を進めることは急務である。最近のウイルス学、分子生物学の進歩をもとに、これらの問題を明らかにしていく。まず、本邦胃癌の7%にも及ぶとされるEBV関連胃癌におけるEBVの果たす役割を明らかにする。ついで、子宮頚癌の原因ウイルスと考えられるパピローマウイルスの臨床病理学的研究を行う。また、ヒト成人型白血病ウイルス(HTLV)がどのようにして細胞増殖を誘導し、最終的には白血化を誘導するかを解明する。次に、癌ウイルスが癌化を起こす基礎的メカニズムを研究するために、癌遺伝子産物Crkによる情報伝達系の解明を行う。また、癌化を引き起こす遺伝子組変えの機序を明らかにする目的で、転座部位に結合するトランスリン蛋白の機能解析を行う。最後に、新しい抗腫瘍剤として注目を集めている細菌由来オリゴヌクレオチドの作用機序解明を行う。
研究方法
?EBV陽性胃癌の培養はexplant法を行い継代した。EBVの感染は臍帯リンパ球のトランスフォーメーションおよびRaji細胞株を標的としたEA誘導能で定量した。さらに、テロメアー長を計ることにより、細胞のクローナリティーを調べた。?性器関連HPV型39種のうち全塩基配列が決定されている30種の塩基配列をGenbankデータベースより得た。HPV67については全塩基配列を決定した。合計31種類のHPV型の全長塩基配列ないし各open reading frame (ORF)の塩基およびアミノ酸配列の相同性をCLUSTAL Vで解析した。?HTLV-I感染者末梢リンパ球(PBMC)は、in vitroで無刺激で自己増殖(Spontaneousproliferation of lymphocyte, SPL)を示す。SPLの特性を把握するためHTLV-I associatedmyelopathy/Tropical spastic paraparesis (HAM/TSP)患者15例の末梢血の供与を受け用いた。T細胞のHTLV-I抗原特異的増殖に関与しAPC上に発現する抗原の検索は、MHCクラスII, クラスI抗原, CD86,CD80, CD58,CD54, CD40L抗原に対する抗体10 mg/ml 存在下でSPLを誘導することで行った。?アダプター型癌遺伝子CRKに結合するC3GおよびDOCK180蛋白の機能解析を行った。C3Gをさまざまな低分子量GTP結合蛋白とともにCos細胞に発現させる。細胞を32P正リン酸で標識した後、これらGTP結合蛋白を回収し、結合しているGTPおよびGDPの量を測定した。?トランスリンと特異的に結合する蛋白のcDNAを酵母Two-Hybrid法でヒトcDNA libraryより単離した。取られたcDNAがコードする蛋白を35Sメチオニンで標識し、大腸菌より精製したトランスリン蛋白と混合することにより、その結合を調べた。?抗がん活性の増強:オリゴDNA:活性型パリンドロームAACGTTを含むOligo-Bを用いた。抗腫瘍活性:IMC腫瘍細胞をマウス皮下に接種した後、それぞれのオリゴDNAを接種局所に投与し、第5週目まで腫瘍径を測定した。サイトカイン産生誘導能:マウス骨髄細胞1x107/mlとオリゴDNAを50 g/mlの濃度で24時間培養した上清中のサイトカイン活性を測定した。
結果と考察
?胃癌摘出材料よりGT38およびGT39に続いてEBV感染上皮系細胞株GTC4を樹立した。GT38およびGT39は肉眼的には非癌組織より取られているのに対し、GTC4は癌組織に由来する点において、大きな進歩である。しかし、蛍光抗体補体法により、
全ての細胞核内にEBNAの発現が見られた。一部の細胞に、ウイルス増殖抗原(lytic antigens)である前初期遺伝子蛋白ZEBRA、早期抗原(earlyantigen; EA)EA-Dおよびエンベロープ蛋白gp350/220の発現が見られ、感染性粒子の産生がおきていると考えられた。細胞内EBV遺伝子は環状エピソームでEBV-DNA末端繰り返し配列の解析からモノクローンのEBV-DNAを有し、各細胞株はモノクローンの起源であることが示唆された。3株とも軟寒天内で高いコロニー形成能を有し、SCIDマウスへの移植で腫瘍が形成された。これらの結果は、EBVが腫瘍化を誘導するということを示唆するが、非癌部の細胞株も同様の性質を示したことから、胃癌との直接的な関連は、症例を増やして検討する必要がある。?31種のHPVの全配列をもとに相同性を調べて、46.5%をカットオフ値として群別に分類することができた。そして、これらをGC含量順にAからJの10群とした。ついで、8種類のORF(E6, E7, E1, E2, E4, E5, L2, L1)について各々塩基およびアミノ酸配列の相同性を比較したところ、各群のHPV型はE4以外の全てのORFで高い類似性を示していた。また、群別されたHPV型は近似の遺伝子の長さとGC含量を有し、特徴あるORFのframeを保持していた。?正常健常者末梢単核球をGM-CSF, IL-4およびTNF 存在下でin vitroで誘導したDCはCell-freeに存在するHTLV-Iに感染し、自己のT細胞を活性化させ増殖させた。ウイルス感染したDCはCD4陽性T細胞もCD8陽性T細胞も活性化させ、HTLV-I感染者にみられるSPLの一因と考えられた。HTLV-I抗原反応性T細胞の増殖を抑制することはウイルス感染細胞数の増加を阻止することに繋がる。?Crk癌遺伝子産物に結合するC3Gが、癌抑制遺伝子Rap1の活性化因子であることを見出した。しかも、CRKの発現によりC3GのRap1活性化が著名に亢進することを見出した。次に、CRKがC3Gを活性化するにはC3Gのどの領域が必要かを調べるために、C3Gの触媒ドメインのみの変異体を用いて同様の解析を行った。すると、C3Gのカルボキシル末端側からなる触媒ドメインのみのものは、野生型のC3Gよりもはるかに強い活性を有することがわかった。しかも、この触媒ドメインのみのC3GはもはやCRKによる活性化を受けなかった。これらのことは、C3Gのアミノ末端側領域がC3Gを負に制御していること、CRKによるC3Gの活性化もまたこのアミノ末端側領域を介して行われることなどが明らかになった。?ヒト造血器腫瘍の染色体切断部位の塩基配列に特異的に結合するDNA結合蛋白トランスリンを発見した。更に、トランスリンの機能を明らかにする目的で、トランスリンと特異的に結合するTRAXおよびTAZ-1蛋白をコードする遺伝子をクローニングした。TRAX蛋白はトランスリン蛋白と高い類似性を示し、N末端に核移行シグナルを備えていた。一方、TAZ-1蛋白はC末端にZnフィンガードメインを備え、N末端は数多くの転写因子と共通するドメイン構造を保有していた。TRAX蛋白は脳神経細胞で高いが、免疫沈降法によって脳神経細胞においてトランスリンと複合体を形成していることが確認された。本来、トランスリンはリンパ球系細胞からホモポリマーとして単離されたので、この事実は、両蛋白の複合体形成が組織特異的制御を受けていることを意味している。?腫瘍細胞をマウスに注射した後、オリゴDNAまたは生理的食塩水0.1mlを腫瘤内投与した。オリゴ-Bは腫瘍増殖抑制効果を示した。サイトカイン産生:マウス骨髄細胞とオリゴ-Bの培養上清中にIFN- 、IFN- 、TNF-、IL-6、IL-12、GM-CSFの産生が認められた。
全ての細胞核内にEBNAの発現が見られた。一部の細胞に、ウイルス増殖抗原(lytic antigens)である前初期遺伝子蛋白ZEBRA、早期抗原(earlyantigen; EA)EA-Dおよびエンベロープ蛋白gp350/220の発現が見られ、感染性粒子の産生がおきていると考えられた。細胞内EBV遺伝子は環状エピソームでEBV-DNA末端繰り返し配列の解析からモノクローンのEBV-DNAを有し、各細胞株はモノクローンの起源であることが示唆された。3株とも軟寒天内で高いコロニー形成能を有し、SCIDマウスへの移植で腫瘍が形成された。これらの結果は、EBVが腫瘍化を誘導するということを示唆するが、非癌部の細胞株も同様の性質を示したことから、胃癌との直接的な関連は、症例を増やして検討する必要がある。?31種のHPVの全配列をもとに相同性を調べて、46.5%をカットオフ値として群別に分類することができた。そして、これらをGC含量順にAからJの10群とした。ついで、8種類のORF(E6, E7, E1, E2, E4, E5, L2, L1)について各々塩基およびアミノ酸配列の相同性を比較したところ、各群のHPV型はE4以外の全てのORFで高い類似性を示していた。また、群別されたHPV型は近似の遺伝子の長さとGC含量を有し、特徴あるORFのframeを保持していた。?正常健常者末梢単核球をGM-CSF, IL-4およびTNF 存在下でin vitroで誘導したDCはCell-freeに存在するHTLV-Iに感染し、自己のT細胞を活性化させ増殖させた。ウイルス感染したDCはCD4陽性T細胞もCD8陽性T細胞も活性化させ、HTLV-I感染者にみられるSPLの一因と考えられた。HTLV-I抗原反応性T細胞の増殖を抑制することはウイルス感染細胞数の増加を阻止することに繋がる。?Crk癌遺伝子産物に結合するC3Gが、癌抑制遺伝子Rap1の活性化因子であることを見出した。しかも、CRKの発現によりC3GのRap1活性化が著名に亢進することを見出した。次に、CRKがC3Gを活性化するにはC3Gのどの領域が必要かを調べるために、C3Gの触媒ドメインのみの変異体を用いて同様の解析を行った。すると、C3Gのカルボキシル末端側からなる触媒ドメインのみのものは、野生型のC3Gよりもはるかに強い活性を有することがわかった。しかも、この触媒ドメインのみのC3GはもはやCRKによる活性化を受けなかった。これらのことは、C3Gのアミノ末端側領域がC3Gを負に制御していること、CRKによるC3Gの活性化もまたこのアミノ末端側領域を介して行われることなどが明らかになった。?ヒト造血器腫瘍の染色体切断部位の塩基配列に特異的に結合するDNA結合蛋白トランスリンを発見した。更に、トランスリンの機能を明らかにする目的で、トランスリンと特異的に結合するTRAXおよびTAZ-1蛋白をコードする遺伝子をクローニングした。TRAX蛋白はトランスリン蛋白と高い類似性を示し、N末端に核移行シグナルを備えていた。一方、TAZ-1蛋白はC末端にZnフィンガードメインを備え、N末端は数多くの転写因子と共通するドメイン構造を保有していた。TRAX蛋白は脳神経細胞で高いが、免疫沈降法によって脳神経細胞においてトランスリンと複合体を形成していることが確認された。本来、トランスリンはリンパ球系細胞からホモポリマーとして単離されたので、この事実は、両蛋白の複合体形成が組織特異的制御を受けていることを意味している。?腫瘍細胞をマウスに注射した後、オリゴDNAまたは生理的食塩水0.1mlを腫瘤内投与した。オリゴ-Bは腫瘍増殖抑制効果を示した。サイトカイン産生:マウス骨髄細胞とオリゴ-Bの培養上清中にIFN- 、IFN- 、TNF-、IL-6、IL-12、GM-CSFの産生が認められた。
結論
日本人に高頻度に発生する胃癌にEBVが関与するかを調べるために、胃癌患者より細胞株を樹立し、これらがEBVを発現していることを確認した。また、子宮頚癌および異型上皮に存在するHPVの型分類を作成し、これらの病理像との対比を行った。た。さらに、日本人に特徴的な成人型白血病がHTLVにより発症する機序を研究した。また、癌遺伝子産物Crkが癌抑制遺伝子Rap1を活性化する機構、染色体転座がトランスリンにより誘導される機構、およびオリゴDNAが抗腫瘍効果を誘導する機序について基礎的研究を行った。
公開日・更新日
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