抗体ライブラリを活用した疾患関連蛋白質可視化解析技術の研究

文献情報

• 文献番号: 200812008A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: 抗体ライブラリを活用した疾患関連蛋白質可視化解析技術の研究
• 課題番号: H18-ナノ・若手-001
• 研究年度: 平成20(2008)年度
• 研究代表者(所属機関): 角田 慎一(独立行政法人医薬基盤研究所 基盤的研究部)
• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 厚生科学基盤研究分野 医療機器開発推進研究（ナノメディシン研究）
• 研究開始年度: 平成18(2006)年度
• 研究終了予定年度: 平成20(2008)年度
• 研究費: 5,000,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

本研究では、細胞内で機能する一本鎖化Fv(scFv)抗体、あるいは細胞内発現型抗体（イントラボディ）を創出し、疾患関連蛋白質の機能解析・機能制御に応用することを目的に、(1)簡便かつ迅速に、微量の抗原蛋白質に対する抗体を創製可能な抗体ライブラリおよび、そのスクリーニング法の確立、(2)それら抗体と蛍光蛋白等との結合体を用い、蛍光分子イメージング技術を活用することで、細胞内疾患関連蛋白質の動態や蛋白間相互作用等を効率よく解析できる技術の開発を目指すものである。本研究により、イントラボディ創出方法の最適化、細胞内疾患関連蛋白質の動態解析による疾患分子病態の解明、治療標的の探索、細胞内分子標的治療薬（細胞内抗体医薬）創出等への展開が期待される。

研究方法

抗体プロテオミクス技術の実証のため、乳がん細胞株の2D-DIGE解析から発現変動蛋白質を同定し、それらに対する抗体作製と、得られたファージ抗体と乳がん組織アレイによる発現プロファイリングにより、有用な乳がん関連蛋白質の絞り込みを行った。絞り込んだ蛋白質の機能解析のため、scFvと蛍光蛋白質Venusの融合体の遺伝子をイントラボディとして細胞に発現させ、標的分子の蛍光イメージングを試みた。

結果と考察

本年度は、まず抗体プロテオミクス技術の実証を試みた。本技術用いて乳がん関連蛋白質の同定を試みたところ、20種類の候補蛋白質を2D-DIGEにより見出した。2D-DIGEゲルから回収した蛋白質の一部を用いて、質量分析により蛋白質を同定し、同時に抗体の単離を試みたところ、全ての候補蛋白質に対する抗体を取得することに成功した。このように、プロテオミクスで同定できる多数の蛋白質に対し、わずか数週間で網羅的に抗体を創製可能な本技術は、極めて有用であると考えられる。さらに、同定した蛋白質の中の機能未知分子の解析を目的に、取得したscFv抗体を蛍光蛋白質との融合蛋白質をとして細胞内で発現させ、蛍光イメージング解析を試みたところ、細胞内の当該標的分子を可視化できる可能性が示唆された。

結論

今後、さらなる最適化等が必要であるが、本研究で開発した技術は、疾患プロテオミクスによる創薬ターゲット、バイオマーカー候補の探索から、可視化機能解析までの絞り込みを効率化し、創薬研究を大きく加速するものと期待される。

公開日・更新日

• 公開日: 2011-05-30
• 更新日: -

文献情報

• 文献番号: 200812008B
• 報告書区分: 総合
• 研究課題名: 抗体ライブラリを活用した疾患関連蛋白質可視化解析技術の研究
• 課題番号: H18-ナノ・若手-001
• 研究年度: 平成20(2008)年度
• 研究代表者(所属機関): 角田 慎一(独立行政法人医薬基盤研究所 基盤的研究部)
• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 厚生科学基盤研究分野 医療機器開発推進研究（ナノメディシン研究）
• 研究開始年度: 平成18(2006)年度
• 研究終了予定年度: 平成20(2008)年度
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

本研究では、細胞内で機能する一本鎖化Fv(scFv)抗体、あるいは細胞内発現型抗体（イントラボディ）を創出し、疾患関連蛋白質の機能解析・機能制御に応用することを目的に、(1)簡便かつ迅速に、微量の抗原蛋白質に対する抗体を創製可能な抗体ライブラリおよび、そのスクリーニング法の確立、(2)それら抗体と蛍光蛋白等との結合体を用い、蛍光分子イメージング技術を活用することで、細胞内疾患関連蛋白質の動態や蛋白間相互作用等を効率よく解析できる技術の開発を目指すものである。

研究方法

最初に、in vitroで迅速に種々の抗原に対するscFv抗体を単離可能とする高品質マウス由来抗体ライブラリの構築を行い、それを応用することにより、プロテオミクスで同定・回収される微量蛋白質に対して抗体を取得しうる技術の確立を試みた。一方で、ファージライブラリ技術を駆使することで、抗体蛋白質等を細胞内に効率よく導入可能なペプチドキャリア（PTD）の創製を試みた。さらに、絞り込んだ蛋白質の機能解析のため、scFvと蛍光蛋白質Venusの融合体の遺伝子をイントラボディとして細胞に発現させ、標的分子の蛍光イメージングを試みることで、確立した技術の有用性評価を行った。

結果と考察

抗体遺伝子増幅用プライマーセットの設計・改良により、多様性に優れたナイーブファージ抗体ライブラリを構築した。本ライブラリを用いれば、種々の蛋白質に対するモノクローナル抗体（scFv抗体）をin vitroで数週間以内に取得可能であることを明らかとした。さらに、本研究で構築した抗体ライブラリを利用することにより、二次元ディファレンシャル電気泳動（2D-DIGE）解析によって同定・回収される、微量の疾患関連蛋白質を抗原として、ダイレクトに抗体を創製しうる技術を確立し、疾患関連蛋白質の効率的絞り込みが可能となった。さらに、抗体等を細胞内に効率よく送達しうる新規PTDを創製するととももに、取得したscFv抗体をイントラボディとして細胞内発現させることで、細胞内の標的分子を可視化解析できることを明らかとした。

結論

本研究で開発したイントラボディによる可視化解析技術は、疾患プロテオミクスによる創薬ターゲット、バイオマーカー候補の探索から、可視化機能解析までの絞り込み過程を効率化し、創薬研究の加速に大きく寄与するものと期待される。

公開日・更新日

• 公開日: 2011-05-30
• 更新日: -

行政効果報告

• 文献番号: 200812008C

成果

• 専門的・学術的観点からの成果: 本研究では、疾患プロテオミクスによる創薬ターゲット、バイオマーカー候補の探索から、可視化機能解析までの絞り込みを効率化しうる技術を開発した。本技術は、近い将来、創薬研究を大きく加速するものと期待される。
• 臨床的観点からの成果: 本技術は疾患関連蛋白質の効率的絞り込みに資するものであり、将来的に診断薬や医薬品の開発に寄与するものと期待される。
• ガイドライン等の開発: 該当なし
• その他行政的観点からの成果: 該当なし
• その他のインパクト: 該当なし

発表件数

• 原著論文（和文）: 0件
• 原著論文（英文等）: 11件
• その他論文(和文): 1件
• その他論文(英文等): 0件
• 学会発表(国内学会): 34件
• 学会発表(国際学会等): 6件
• その他成果(特許の出願): 0件 ; 「出願」「取得」計1件
• その他成果(特許の取得): 0件
• その他成果(施策への反映): 0件
• その他成果(普及・啓発活動): 0件

主な原著論文20編（論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限る）

• 原著論文1: Imai S., Mukai Y., Nagano K. et al.; Quality enhancement of the non-immune phage scFv library to isolate effective antibodies.; Biol. Pharm. Bull. , 29 (7) , 1325-1330 (2006)
• 原著論文2: Mukai Y., Sugita T., Yamato T. et al.; Creation of novel protein transduction domain (PTD) mutants by a phage display-based high-throughput screening system.; Biol. Pharm. Bull. , 29 (8) , 1570-1574 (2006)
• 原著論文3: Kawamura M., Shibata H., Kamada H. et al.; A novel method for construction of gene fragment library to searching epitopes. ; Biochem. Biophys. Res. Commun. , 346 , 198-204 (2006)
• 原著論文4: Sugita T., Yoshikawa T., Mukai Y. et al.; Improved cytosolic translocation and tumor-killing activity of Tat-shepherdin conjugates mediated by co-treatment with Tat-fused membrane-disruptive HA2 peptide.; Biochem. Biophys. Res. Commun. , 363 , 1027-1032 (2007)
• 原著論文5: Nomura T., Kawamura M., Shibata H. et al.; Creation of novel cell penetrating peptide, using random 18mer peptides library.; Pharmazie , 62 , 569-573 (2007)
• 原著論文6: Kamada H., Okamoto T., Kawamura M et al.; Creation of novel cell-penetrating peptides for intracellular drug delivery using systematic phage display technology originated from Tat transduction domain.; Biol. Pharm. Bull. , 30 (2) , 218-223 (2007)
• 原著論文7: Yoshikawa T., Sugita T., Mukai Y. et al.; Organelle-targeted delivery of biological macromolecules using the protein transduction domain Potential applications for peptide aptamer delivery into the nucleus.; J. Mol. Biol. , 380 , 777-782 (2008)
• 原著論文8: Imai S., Mukai Y., Takeda T. et al.; The effect of protein properties on display efficiency using the M13 phage display system.; Pharmazie (2008)
• 原著論文9: Nagano K., Imai S., Mukai Y. et al.; Rapid isolation of intrabody candidates by using an optimized non-immune phage antibody library.; Pharmazie (2009)
• 原著論文10: Yoshikawa T., Sugita T., Mukai Y. et al.; The augmentation of intracellular delivery of peptide therapeutics by artificial protein transduction domains.; Biomaterials (2009)

公開日・更新日

• 公開日: 2015-05-26
• 更新日: -