細胞内元素アレイ解析の臨床応用に向けた基礎研究

文献情報

• 文献番号: 200812002A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: 細胞内元素アレイ解析の臨床応用に向けた基礎研究
• 課題番号: H18-ナノ・一般-002
• 研究年度: 平成20(2008)年度
• 研究代表者(所属機関): 志村 まり(国立国際医療センター研究所 難治性疾患研究部難治性疾患研究室)

研究分担者(所属機関)

• 山内　和人(大阪大学大学院工学研究科超精密加工)
• 松山　智至(大阪大学大学院工学研究科超精密加工)
• 前島　一博(理化学研究所・中央研究所今本核研究室)
• 萩原將太郎(国立国際医療センター血液内科)
• 岡村　匡史(国立国際医療センター研究所ヒト型動物開発研究室)
• 石川　哲也(理化学研究所播磨研究所)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 厚生科学基盤研究分野 医療機器開発推進研究（ナノメディシン研究）
• 研究開始年度: 平成18(2006)年度
• 研究終了予定年度: 平成20(2008)年度
• 研究費: 40,664,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

細胞内元素を可視化する方法として、細胞レベルで直接元素分布を解析した報告は少ない。細胞レベルで網羅的に元素分布を可視化することで、初めて元素変動と蛋白質や遺伝子発現との対応も可能となり、多角的な視点での細胞機能や病態への理解が可能となることが期待される。走査型蛍光X線顕微鏡(SXFM)の改良に加えて、細胞内元素高速測定、医学生物応用、次世代放射光源を用いた場合の当該手法の拡張を目的とする。

研究方法

a．細胞観察用SXFMシステムの高速測定およびユーザーフレンドリー化
b. SXFMの生物・医学応用
１）ATP7bトランスジェニックラット（TGLEC）の作成とSXFMによる元素局在解析
２）蛋白質結合元素の電気泳動による可視化
３）血漿中23元素のICP-MS同時解析
４） 次世代放射光源を用いた場合の当該手法の拡張性
倫理面への配慮；臨床試料を用いる場合は、インフォームドコンセントを十分配慮する。当該機関の患者検体倫理委員会に諮問てから行う（承認済み）。動物実験は、当該機関の動物委員会に報告し、動物愛護への配慮を欠くことのないよう計画する。組換DNA実験はカルタヘナ条約を遵守する。

結果と考察

a. 細胞観察用SXFMシステムの開発；情報処理、MCA、検出器の改良を行い、1/17に短縮できる所見を得た。
b. SXFMの生物・医学応用
１）銅代謝異常や肝炎・がんで知られているLECラットの原因遺伝子のTGLECを作成した。TGLECはLECと比較して、肝炎の発症はなく、銅の細胞内局在変化が認められた。
２）等電点電気泳動法での蛋白質結合元素の検出が、SXFMイメージングにより可能となった。
３）血漿での元素変動について、健常人ボランティア、血液癌患者での、ICP-MSでの微量元素分析および比較検討を試みた。統計学的有為な元素変動が血液癌患者には認められた。
４）光の波がそろったコヒーレントなX線を活用した新しいタイプのX線顕微鏡（Ｘ線ナノＣＴ）を開発し、ヒト染色体の内部構造の可視化に成功した。
本年度の試料測定結果から、細胞内網羅的元素の測定は、細胞機構や病態を理解する上で有用と考える。生物試料の効率の良い測定やユーザーズフレンドリー化を今後完成することで、統計学的なデータに基づいた測定が簡便になり、より積極的な生物医学情報を発信できるシステムに発展したと考える。将来のSPring-8におけるSXFM専用ビームラインでの貢献が期待できる。

結論

細胞内外の微量元素の分布や量を網羅的に調べることは、正常な生体や病態を理解するために有用な方法である。

公開日・更新日

• 公開日: 2011-05-30
• 更新日: -

文献情報

• 文献番号: 200812002B
• 報告書区分: 総合
• 研究課題名: 細胞内元素アレイ解析の臨床応用に向けた基礎研究
• 課題番号: H18-ナノ・一般-002
• 研究年度: 平成20(2008)年度
• 研究代表者(所属機関): 志村 まり(国立国際医療センター研究所 難治性疾患研究部難治性疾患研究室)

研究分担者(所属機関)

• 山内　和人(大阪大学大学院工学研究科超精密加工)
• 松山　智至(大阪大学大学院工学研究科超精密加工)
• 三村　秀和(大阪大学大学院工学研究科超精密加工)
• 前島　一博(理化学研究所・中央研究所今本核研究室)
• 萩原將太郎(国立国際医療センター血液内科)
• 岡村　匡史(国立国際医療センター研究所ヒト型動物開発研究室)
• 石川　哲也(理化学研究所播磨研究所)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 厚生科学基盤研究分野 医療機器開発推進研究（ナノメディシン研究）
• 研究開始年度: 平成18(2006)年度
• 研究終了予定年度: 平成20(2008)年度
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

細細胞レベルでの網羅的な元素の可視化は、元素変動と蛋白質や遺伝子発現との対応も可能とし、多角的な視点での細胞機能や病態への理解が期待される。走査型蛍光X線顕微鏡(SXFM)の開発および細胞の網羅的元素分析を通して、生物医学応用を図る。

研究方法

a．細胞観察用SXFMシステム開発
１）ズーム機構付きSXFM
２）走査型蛍光X線CT
３）クライオ走査型蛍光X線顕微鏡
４）定量化
５）高速測定システム
b. SXFMの生物・医学応用のための手法
１）SXFM専用基板開発
２）稀少検体からの切片作成
３）SXFMのための凍結切片試料作成
４）SXFMのための動物組織固定
５）エレメントアレイ解析
６）元素結合蛋白質の精製・同定
７）蛋白質結合元素の電気泳動による可視化
８）院内での臨床検体採得から超低温保存とSXFM測定
９）血漿中23元素のICP-MS同時解析
c. 次世代放射光源を用いた場合の当該手法の拡張
倫理面への配慮は適切に行った。

結果と考察

a．
１）SXFMの光源からの光子数を制御するズーム機構の設置。
２）体毛内部の3次元元素分布の可視化に成功。
３）クライオ走査型蛍光X線顕微鏡の開発計測に成功。
４）SXFMで観察される蛍光X線強度の絶対値定量化に成功。
５）情報処理、MCA、検出器の改良を行い、1/17に短縮。
b.
１）生体では重要なリン(P)の測定を可能にするために、新基板(PCAD)を作成。
２）稀少検体からの薄切片作成後PCAD上でのSXFM測定に成功。
３）細胞の瞬間急速凍結或いは乾燥処理後のSXFM測定に成功。
４）動物組織固定法を検討し、組織切片でのSXFM 測定に成功。
５）細胞の元素情報を網羅的に示す方法として、元素アレイ解析を提案。
６）SXFM 測定で局在が明らかになった元素結合蛋白質同定法を確立。
７）等電点電気泳動法での蛋白質結合元素の検出を、SXFM測定により成功。
８）検体提供者に対するインフォームドコンセントから保存方法を院内で確立。
９）血液癌患者・健常人血漿で元素のICP-MS微量元素分析。
c. 次世代X線顕微鏡（Ｘ線ナノＣＴ）を開発し、ヒト染色体の内部構造の可視化に成功。

細胞内網羅的元素の測定は、生体反応を理解する上で有用である。高速測定化と共に統計学的なデータに基づいた医学生物情報を発信できるシステムが完成する。

結論

細胞内外の微量元素の分布や量を網羅的に調べることは、正常な生体や病態を理解するために有用な方法である。

公開日・更新日

• 公開日: 2011-05-30
• 更新日: -

行政効果報告

• 文献番号: 200812002C

成果

• 専門的・学術的観点からの成果: 微量元素が生体にとって重要であることは、周知である。未だに知られていない蛋白活性に関わる元素も潜在するだろう。本研究; の走査型蛍光X線顕微鏡(SXFM)の開発より、細胞内元素分布のナノメーター単位での解画像に成功している。網羅的元素分析を通; して展開した研究では、疾患モデル動物の細胞に特異な元素局在を見いだし、特異元素の結合蛋白質を同定し、疾患の機序に及ぶ; 研究が展開した。細胞機能や病態を明らかにする新しい視点と手法を見いだした点で、本研究の貢献は大きい。
• 臨床的観点からの成果: 臨床疾患検体を用いたSXFMやICP-MSによる網羅的元素分析を行ってきた。健常人ボランティア検体と比較して、統計学的に有為な差を持って増大および減少する元素が疾患で認められる。今後症例数を増大し、さらに統計学的根拠に基づき、疾患特異的な元素変動を見いだすことも可能と考える。
• ガイドライン等の開発: 該当無し
• その他行政的観点からの成果: 該当無し
• その他のインパクト: 大阪大学山内らの行ったSXFMシステム開発に使用したX線集光システム(K-Bミラー)については、朝日新聞、読売新聞でも取り上げられている（2008年8月7日）。また、理研前島らによる次世代X線顕微鏡（Ｘ線ナノＣＴ）を開発によるヒト染色体の内部構造の可視化については、朝日新聞（2009年12月29日）、Nature Research Highlight(2009), 米国物理学会誌(Physics Today, the latest in research, 2009)でも掲載された。

発表件数

• 原著論文（和文）: 0件
• 原著論文（英文等）: 4件
• その他論文(和文): 0件
• その他論文(英文等): 0件
• 学会発表(国内学会): 14件
• 学会発表(国際学会等): 18件
• その他成果(特許の出願): 0件 ; 「出願」「取得」計0件
• その他成果(特許の取得): 0件
• その他成果(施策への反映): 0件
• その他成果(普及・啓発活動): 0件

主な原著論文20編（論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限る）

• 原著論文1: Nishino Y. et al.; Three-Dimensional Visualization of a Human Chromosome Using Coherent X-ray Diffraction; Physical Review Letters , 102 , 18101-18104 (2009)
• 原著論文2: Matsuyama S., et al.; Trace element mapping of a single cell using a hard x-ray nanobeam focused by a Kirkpatrick-Baez mirror system; X-ray Spectrometry , 38 , 89-94 (2009)
• 原著論文3: Eltsov M. et al.; Analysis of cryo-electron microscopy images does not support the existence of 30-nm chromatin fibers in mitotic chromosomes in situ.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , 105 , 19732-19737 (2008)
• 原著論文4: Yamagishi Y, et al; Heterochromatin links to centromeric protection by recruiting shugoshin.; Nature , 455 , 251-255 (2008)
• 原著論文5: Matsuyama S., et al.; Trace element mapping using a high-resolution scanning X-ray fluorescence microscope equipped with a Kirkpatrick-Baez mirror system; Surf. Interface Anal. , 40 , 1042-1045 (2008)

公開日・更新日

• 公開日: 2015-05-26
• 更新日: -