住肉胞子虫による国産ジビエの食中毒リスク評価に関する研究

文献情報

• 文献番号: 202024008A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: 住肉胞子虫による国産ジビエの食中毒リスク評価に関する研究
• 課題番号: H30-食品-若手-003
• 研究年度: 令和2(2020)年度
• 研究代表者(所属機関): 山崎 朗子(岩手大学 農学部)

研究分担者(所属機関)

• 入江　隆夫(宮崎大学　農学部　獣医学科)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 健康安全確保総合研究分野 食品の安全確保推進研究
• 研究開始年度: 平成30(2018)年度
• 研究終了予定年度: 令和2(2020)年度
• 研究費: 4,833,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

近年、害獣を食肉利用する地域振興事業が盛んである。これまでの疫学調査で、E型肝炎ウイルス、志賀毒素産生大腸菌、サルモネラ、肝蛭、住肉胞子虫等の保有が認められたが、細菌および寄生虫については内臓の廃棄により食中毒リスクを回避でき、E型肝炎は遺伝子検出率（イノシシ2.4％、シカ0.1％）を考慮すると深刻な食中毒危害や経済損害には直結しない。しかし住肉胞子虫は可食部位に寄生し、シカでの陽性率が100％であること、シカ肉の生食で食中毒が発生したことから、ジビエ産業振興への障害となる。はっきりと食中毒事例が認められたウマのS.fayeriと異なり、ジビエの住肉胞子虫は詳細が不明なため届出指定対象外であるが、馬肉に似た赤身のシカ肉は半生や生食が好まれ、食中毒リスクの高い状態で流通・提供されている。そのためこれらの毒性の解析は、食中毒発生予防のためにも、本虫による食中毒様症状発生時に正確に対応するためにも早急な解決が求められる。ジビエの中でも特に消費量の多いエゾシカ肉については、寄生する住肉胞子虫種の同定をほぼ完了し、またホンシュウジカ寄生種については共同研究により新種を含む７種を同定した。今年度は、九州産ジビエ（キュウシュウジカ、イノシシ、およびアナグマ）を対象に、住肉胞子虫の流行状況の把握を研究目的とした。

研究方法

馬肉およびシカ肉からSarcocysits属原虫を分離して分子量依存的に分画し、ウサギの腸管ループ試験に供試した。また、各種かのブラディゾイトを遊離させ、U937 ヒトマクロファージ細胞と共培養し、産生サイトカインをアレイにて網羅的に検出した。

結果と考察

馬肉由来のS. fayeri由来のタンパク質分画を用いたウサギ腸管ループ試験において，>25 kDa分画投与ループで出血を認めた。他の分画を投与したループ全てで液体貯留を認めなかったことから、S. fayeriの出血因子は>25 kDa分画に含まれており、下痢誘導因子とは別の因子であることが示唆された。
シカ肉由来のS. japonicaおよびS. cf. tarandiのタンパク質分画を用いたウサギ腸管ループ試験において， 17～50 kDa分画および15～37 kDa分画投与ループに非出血性液体貯留がみられた。15～37 kDa分画にはS. fayeriの腸管毒性候補因子であるADF、17～50 kDa分画には本研究課題にて昨年度に報告した19kDaタンパク質(pHRF)が含まれることから，S. japonicaおよびS. cf. tarandiにもS. fayeri同様にADF、19kDaタンパク質が存在する可能性が示された。
S. japonicaおよびS. cf. tarandiを用いたウサギ腸管ループ試験において，106、10⁷ ブラディゾイト投与ループで液体貯留を示した。本研究課題昨年度報告にて示したウマ寄生S. fayeriの液体貯留発現投与量10³ ブラディゾイトと比較すると、S. japonicaおよびS. cf. tarandiの下痢毒性はS. fayeriより低いことが推察される。
S. fayeriブラディゾイト刺激によりヒトマクロファージ細胞からMCP-1,MIP-1α，MMP-9，RANTES，VEGFの分泌増加を認めたが，IFN-γ，IL-6，IL-12，TNF-αは検出されなかった。一方，シカ寄生Sarcocystis属でも同様のケモカイン産生であったが、産生量はS. fayeriの二倍以上だった。S. fayeriの腸管毒性因子ADFがRAW264細胞のTNF-α遺伝子発現を誘導するとの報告があったが［Irikura et al.，2017］，本研究では認められなかった。RANTES，MIP-1α,VEGFはアレルギー指標でもあることから,Sarcocystis属の腸管毒性は，アレルギーと炎症反応が相互に関与する可能性がある。

結論

ウマ由来S. fayeriとシカ由来S. japonicaおよびS. cf. tarandiは類似した分子量の腸管毒性候補因子を保有しているが、その作用の大きさは異なっている。また、in vivo試験の結果から想定していた炎症反応はin vitro試験の結果と合致せず、Sarcocystis属が起こす腸管毒性の機序の複雑さが示唆された。

公開日・更新日

• 公開日: 2023-05-01
• 更新日: -

文献情報

• 文献番号: 202024008B
• 報告書区分: 総合
• 研究課題名: 住肉胞子虫による国産ジビエの食中毒リスク評価に関する研究
• 課題番号: H30-食品-若手-003
• 研究年度: 令和2(2020)年度
• 研究代表者(所属機関): 山崎 朗子(岩手大学 農学部)

研究分担者(所属機関)

• 入江　隆夫(宮崎大学　農学部　獣医学科)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 健康安全確保総合研究分野 食品の安全確保推進研究
• 研究開始年度: 平成30(2018)年度
• 研究終了予定年度: 令和2(2020)年度
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

近年、害獣を食肉利用する地域振興事業が盛んである。これまでの疫学調査で、E型肝炎ウイルス、志賀毒素産生大腸菌、サルモネラ、肝蛭、住肉胞子虫等の保有が認められたが、細菌および寄生虫については内臓の廃棄により食中毒リスクを回避でき、E型肝炎は遺伝子検出率（イノシシ2.4％、シカ0.1％）を考慮すると深刻な食中毒危害や経済損害には直結しない。しかし住肉胞子虫は可食部位に寄生し、シカでの陽性率が100％であること、シカ肉の生食で食中毒が発生したことから、ジビエ産業振興への障害となる。はっきりと食中毒事例が認められたウマのS.fayeriと異なり、ジビエの住肉胞子虫は詳細が不明なため届出指定対象外であるが、馬肉に似た赤身のシカ肉は半生や生食が好まれ、食中毒リスクの高い状態で流通・提供されている。そのためこれらの毒性の解析は、食中毒発生予防のためにも、本虫による食中毒様症状発生時に正確に対応するためにも早急な解決が求められる。

研究方法

国内全域から採取した野生ニホンジカ筋肉組織から住肉胞子虫シストを回収し、ゲルろ過法により分画する。麻酔下にてウサギ(10週齢Japanese White)を開腹し、空腸部に閉鎖管腔(ループ)を作る。各ループに分画した各タンパク質画分、陽性対照(ウェルシュ菌毒素)、陰性対照(PBS)を投与し18 - 24時間にループ内液体貯留と出血を確認する。下痢毒性の評価は、ループ長あたりの液体量(ul/cm :FA値)で行い、毒性を示したタンパク質分画を選定する。
選定した分画のアミノ酸配列を決定し、BLAST検索にてタンパク質を同定、毒性候補タンパク質とする。
in vivoバイオアッセイで選定したタンパク質分画を用いてCaco-2ヒト腸管上皮由来細胞を刺激し、細胞形態と細胞活性度の変化から細胞傷害性を評価する。また、U937マクロファージ系細胞、Hela上皮系細胞など、腸管在性サイトカイン産生細胞を用いて同様に刺激実験を行う。培養液中に産生されたサイトカインをアレイにより網羅的に検出し、炎症やアレルギー等の生体反応を評価する。
上記の毒性候補タンパク質を大腸菌発現系にて組換えタンパク質として単独的に作製し、同様のin vivo、in vitroバイオアッセイを行い、毒性候補タンパク質を決定する。
単離シストから核酸を抽出し、毒性候補タンパク質の遺伝子配列を決定する。各住肉胞子虫種間での遺伝子配列を比較し、種間相違から住肉胞子虫種間における毒性の有無、強弱を考察する。

結果と考察

ウマ由来Sarcocystisをゲルろ過分画し、各分画を腸管ループテストに供したところ、15kDa(ADF：アクチン脱重合因子。毒性候補因子)分画より高分子量の分画でも液体貯留が認められた。このタンパク質について。nano-LC/MS/MSによりアミノ酸配列解析を行った結果、putative Histamine releasing factor（pHRF）であった。同様にシカ肉由来のS. japonicaおよびS. cf. tarandiのタンパク質分画を用いた結果も同様であったため、Sarcocysits属に共通する因子だと考えられる。細胞刺激によるサイトカインアッセイの結果は、MCP-1,MIP-1α，MMP-9，RANTES，VEGFが産生誘導されたが、代表的な炎症性サイトカインは産生されなかった。また、S. fayeriよりもS. japonicaおよびS. cf. tarandiによる刺激の方が多量のサイトカイン産生を誘導した。

結論

ウマ寄生S. fayeriとシカ寄生S. japonicaおよびS. cf. tarandiではin vivo試験での腸管毒性について強度や症状に関する相違点があるが、作用する毒性候補タンパク質は共通していることが示唆された。しかし、in vivo試験で認められた毒性の強弱とin vitroで認められた反応性の強弱は相関しておらず、Sarcocystisによって引き起こされる腸管毒性が感染に対する単純な炎症症状の結果でなく、もっと複雑な機序に起因することが示唆される。

公開日・更新日

• 公開日: 2023-05-01
• 更新日: -

行政効果報告

• 文献番号: 202024008C

成果

• 専門的・学術的観点からの成果: 住肉胞子虫の病原性について、下痢を主徴とする腸管毒性の最少発現量、毒性因子候補タンパク質の検出、細胞毒性の有無を確認した。毒性因子は既報に加えて新たな因子が推定された。特にシカに寄生する住肉胞子虫の毒性検証は初報告である。
• 臨床的観点からの成果: 住肉胞子虫のヒトに対する毒性が、既報の馬に寄生するS. fayeriによる食中毒だけでなく、シカ肉に寄生する種でも起こりうる可能性が示唆されたことから、ジビエの調理法については、加熱必須であることをより強調する必要性が明らかとなった。
• ガイドライン等の開発: 野生鳥獣肉の衛生管理に関する指針（ガイドライン）を他のジビエ研究班の研究成果とも合わせ、少しずつ改訂を試みている。
• その他行政的観点からの成果: 住肉胞子虫の毒性に関する研究を実施し、毒性発現量、毒性を保有する種、毒性失活の確認、毒性因子タンパク質を明らかにした。これらの研究成果は、ジビエの利活用に関する各種公開情報の一つとしてジビエの衛生管理の推進に貢献する。
• その他のインパクト: 本研究結果を岩手県公衆衛生獣医師研修会、食鳥検査員研修会の講義で紹介し、本県で行われるジビエ産業の推進における衛生管理の一助として貢献している。また、公益社団法人日本獣医学会市民公開講座にて情報を公開した。

発表件数

• 原著論文（和文）: 0件
• 原著論文（英文等）: 2件
• その他論文(和文): 0件
• その他論文(英文等): 2件
• 学会発表(国内学会): 9件
• 学会発表(国際学会等): 0件
• その他成果(特許の出願): 0件
• その他成果(特許の取得): 0件
• その他成果(施策への反映): 0件
• その他成果(普及・啓発活動): 1件 ; アグリビジネス創出フェア1件

主な原著論文20編（論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限る）

• 原著論文1: Yamazaki, A., Shirafuji, Y. and Kamata, Y.; The relationship between epidemiological factors and the parasite load of Sarcocystis in Yezo-deer (Cervus nippon yesoensis) in Hokkaido, Japan.; Foodborne Pathog. Dis. (2023)
• 原著論文2: Yamazaki, A., Shirafuji, Y. and Kamata, Y.; Establishment of a novel molecular detection method for Sarcocystis in venison. ; Foodborne Pathog. Dis. (2020)

公開日・更新日

• 公開日: 2023-06-23
• 更新日: -

収支報告書

• 文献番号: 202024008Z
• 報告年月日: 2021年11月18日

収入

• (1)補助金交付額: 6,282,000円
• (2)補助金確定額: 6,282,000円
• 差引額 [(1)-(2)]: 0円

支出

研究費 (内訳)	直接研究費	物品費	3,450,308円
		人件費・謝金	516,722円
		旅費	86,560円
		その他	779,410円
	間接経費		1,449,000円
	合計		6,282,000円

備考

• 備考: -

公開日・更新日

• 公開日: 2023-09-05
• 更新日: -