角膜上皮細胞の生体外での未分化能維持の研究

文献情報

• 文献番号: 200806001A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: 角膜上皮細胞の生体外での未分化能維持の研究
• 課題番号: H18-再生・若手-002
• 研究年度: 平成20(2008)年度
• 研究代表者(所属機関): 川北 哲也(慶應義塾大学 医学部 眼科学教室)

研究分担者(所属機関)

• 榛村　重人(慶應義塾大学　医学部　眼科学教室)
• 比嘉　一成(東京歯科大学　眼科)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 厚生科学基盤研究分野 再生医療実用化研究
• 研究開始年度: 平成18(2006)年度
• 研究終了予定年度: 平成20(2008)年度
• 研究費: 5,000,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

前年度TGF-βの刺激によるEMTの誘導実験を行い、TGF-βの関与を示したが、その分子メカニズムについて、Smad、Wnt Pathwayの活性化をを介しているかについて研究を行った。また、海外アイバンクのドナー眼の角膜輪部組織を用い、ヒトでの角膜上皮細胞の生体外での未分化能維持に輪部の構造自体が影響しているかどうかを調べた。

研究方法

1．異常分化の研究
①.マウス角膜上皮未分化細胞の通常培養
②.TGF-β刺激（５ng/ml）48時間刺激する
③.細胞を固定し、Smad3、βカテニンの免疫染色で核内移行があるか観察する
④.時間経過でsnailなど、そのほかのEMT関連分子の発現を確認する
2.　 角膜輪部上皮組織構造のニッチとしての役割の研究
①.アイバンク(海外)の輪部組織をDispase処理（14h、4度）
②.p63（4A4）の免疫染色を行い、p63陽性細胞塊を観察する
③.p63陽性細胞塊の多い部分、少ない部分をレーザーマイクロダイセクションで切り出し、コロニー形成率を比較する。

結果と考察

1．異常分化の研究
TGF-β刺激にことにより、Smad、βカテニンの細胞間から細胞質への移行、また核内にも移行する染色像が観察された。またsnailといったEMT時に上昇する分子も上昇が確認された。
2．角膜輪部上皮組織構造のニッチとしての役割の研究
角膜上皮シートとして一塊に分離した輪部シート構造の中にはp63陽性の細胞塊が局在し、そのp63陽性の細胞塊を多く含む領域は、少ない領域と比較しコロニー形成率が有意に高かった。

結論

1.マウス角膜上皮未分化細胞のTGF-βによるEMTは、Wnt,Smadの活性化を介していた。
2.ヒト輪部角膜にはp63陽性細胞塊が含まれており、その構造を維持することが未分化性維持、細胞老化遅延に関係するかもしれない。

公開日・更新日

• 公開日: 2011-05-27
• 更新日: -

文献情報

• 文献番号: 200806001B
• 報告書区分: 総合
• 研究課題名: 角膜上皮細胞の生体外での未分化能維持の研究
• 課題番号: H18-再生・若手-002
• 研究年度: 平成20(2008)年度
• 研究代表者(所属機関): 川北 哲也(慶應義塾大学 医学部 眼科学教室)

研究分担者(所属機関)

• 榛村　重人(慶應義塾大学　医学部　眼科学教室)
• 比嘉　一成(東京歯科大学　眼科)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 厚生科学基盤研究分野 再生医療実用化研究
• 研究開始年度: 平成18(2006)年度
• 研究終了予定年度: 平成20(2008)年度
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

　化学外傷、熱傷などに続発する重症角結膜疾患においては、角膜上皮を再建するために、自己の片眼、他眼の角膜上皮を用い，生体外で培養し移植する方法があるが、限られた細胞ソースから効率よく培養する方法が必須である。その上皮培養の方法をマウスを用いて検討し、より少ない組織から幹細胞の未分化能を維持する方法を開発することを目的とする。

研究方法

1． マウス角膜培養上皮細胞の分離培養、上皮シート作成
2.　マウス上皮シートをウサギ、マウス角膜へ移植し組織を評価
3.　in vitroでの分化、異常分化のメカニズム解明
4. in vitroでのPax6の遺伝子導入後の細胞携帯、表現型の評価
5.　TSA刺激実験
6.　通常培養におけるEMTの発生頻度とメカニズムの解明

結果と考察

長期継代培養した細胞からも重層化マウス上皮シートを作成でき、免疫染色、RT-PCRでケラチン14（+）ケラチン10 (-) p63（+）だが、ケラチン12(-)Pax6(-)であった。上皮シートをウサギ、マウス角膜へ移植したが、生着率は低く、技術的な課題を残した。in vitroでの異常分化には、播種細胞密度、血清添加、またTGF-β濃度が関係していた。in vitroでケラチン12(-)のこの細胞にTSA刺激を加えると、ＲＮＡレベルでケラチン12発現を認めた。

結論

長期継代培養した細胞から重層化マウス上皮シートを作成でき、マウス角膜上皮未分化細胞の維持には、播種細胞密度、無血清、低カルシウム濃度であることが必要であり、その異常分化にはTGF-β濃度が関与していた。

公開日・更新日

• 公開日: 2011-05-27
• 更新日: -

行政効果報告

• 文献番号: 200806001C

成果

• 専門的・学術的観点からの成果: 低細胞外Ca2+濃度と無血清培養により、p63強陽性、かつClonalに培養可能なマウス角膜上皮細胞の分離培養し、この細胞を用いて、ひとつの未分化角膜上皮細胞から、角膜を覆う重層化培養上皮シートを作成した。この細胞がケラチン12陰性なのは、異常分化したわけではなく、エピジェネティックな変化を受けた結果によること、また異常分化しないよう維持するために、播種細胞密度も大事なことがわかった。
• 臨床的観点からの成果: ヒト角膜輪部未分化角膜上皮細胞を生体外で培養する際の条件で、低細胞外Ca2+濃度と無血清培養を用い、重層化シート作成時に培養条件を変化させることにより、従来よりも質の高い（未分化細胞リッチ）上皮シートが作成可能と考えられる。
• ガイドライン等の開発: なし
• その他行政的観点からの成果: なし
• その他のインパクト: なし

発表件数

• 原著論文（和文）: 0件
• 原著論文（英文等）: 7件
• その他論文(和文): 0件
• その他論文(英文等): 0件
• 学会発表(国内学会): 1件
• 学会発表(国際学会等): 4件
• その他成果(特許の出願): 0件 ; 「出願」「取得」計0件
• その他成果(特許の取得): 0件
• その他成果(施策への反映): 0件
• その他成果(普及・啓発活動): 0件

主な原著論文20編（論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限る）

• 原著論文1: Kawakita T, Shimmura S, Higa K et al.; Greater Growth Potential of p63-positive Epithelial Cell Clusters Maintained in Human Limbal Epithelial Sheets; Invest Ophthalmol Vis Sci. in print (2009)
• 原著論文2: Ma X, Shimmura S, Miyashita H et al.; Long-Term Culture and Growth Kinetics of Murine Corneal Epithelial Cells Expanded from Single Corneas; Invest Ophthalmol Vis Sci.in print (2009)
• 原著論文3: Omoto M, Miyashita H, Shimmura S et al.; The use of human mesenchymal stem The use of human mesenchymal stem cell-derived feeder cells for the cultivation of transplantable epithelial sheets; Invest Ophthalmol Vis Sci.in print (2009)
• 原著論文4: Kawakita T, Shimmura S, Higa K et al.; Stratified epithelial sheets engineered from a single adult murine corneal/limbal progenitor cell; J Cell Mol Med. , 4 (130) , 3-16 (2008)
• 原著論文5: Miyashita H, Shimmura S, Higa K et al.; A novel NIH/3T3 duplex feeder system to engineer corneal epithelial sheets with enhanced cytokeratin 15-positive progenitor populations.; Tissue Eng Part A. , 7 , 1275-1282 (2008)
• 原著論文6: Miyashita H, Higa K, Kato N et al.; Hypoxia enhances the expansion of human limbal epithelial progenitor cells in vitro.; Invest Ophthalmol Vis Sci. , 48 (8) , 3586-3593 (2007)
• 原著論文7: Higa K, Shimmura S, Kato N et al.; Proliferation and differentiation of transplantable rabbit epithelial sheets engineered with or without an amniotic membrane carrier.; Invest Ophthalmol Vis Sci. , 48 (2) , 597-604 (2007)

公開日・更新日

• 公開日: 2015-05-26
• 更新日: -