ヒトＥＳ細胞由来心筋細胞の表面マーカー探索および大量培養・純化システムの構築

文献情報

• 文献番号: 200711006A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: ヒトＥＳ細胞由来心筋細胞の表面マーカー探索および大量培養・純化システムの構築
• 課題番号: H19-生物資源-一般-006
• 研究年度: 平成19(2007)年度
• 研究代表者(所属機関): 日高 京子(国立循環器病センター 研究所バイオサイエンス部)

研究分担者(所属機関)

• 森崎　隆幸(国立循環器病センター　研究所バイオサイエンス部 )

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 厚生科学基盤研究分野 創薬基盤推進研究（生物資源研究）
• 研究開始年度: 平成19(2007)年度
• 研究終了予定年度: 平成21(2009)年度
• 研究費: 11,700,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

本研究はES細胞より大量にかつ効率よく心筋細胞を得るために、心筋およびその前駆細胞で発現するマーカーを探索し、大量かつ効率的な分化誘導系とともに純度の高い単離法を開発することを目的とする。そこで（１）高効率分化誘導条件の検討と網羅的発現遺伝子解析によるマーカー候補遺伝子の同定、（２）胚様体に存在する心筋以外の細胞種の同定、（３）胚様体大量形成法の確立を目的とした。

研究方法

本年度における研究はすべてマウスES細胞を用いて行った。さまざまな条件で培養した胚様体サンプルからRNAを調製しDNAマイクロアレイを用いて発現遺伝子を網羅的に解析した。候補遺伝子についてマウス胚のWhole mount in situ hybridizationやRT-PCRを行い、発現部位や特異性を解析した。胚様体形成についてはマイクロウェルチップなど新規デバイスを用いた方法を検討し、心筋細胞の割合や発現遺伝子のレベルを測定した。

結果と考察

（１）候補マーカーＸの同定。われわれはES細胞において一時的な血清除去が高効率に心筋を誘導することを見出し、表面マーカー候補遺伝子「マーカーＸ」を見出した。マーカーＸはマウス胚では心臓原基に発現が始まり、原始心筒においても発現が持続していた。このマーカーにより胚様体をＸ陽性およびＸ陰性の分画に分離したところ、Ｘ陽性の分画からのみ心筋細胞が生じた。
（２）胚様体における心内膜細胞の同定。胚様体発現遺伝子の中には心臓領域では発現するものの心筋で必ずしも発現しない遺伝子も存在していた。これらの遺伝子がマウス胚心臓のCD31陽性集団に発現していたことから心内膜細胞が心筋細胞とともに誘導されていることが示唆された。
（３）胚様体大量形成法の検討。平方センチあたり1000個のマイクロウェルを持つチップを用いた「EB形成チップ法」および384V底プレートを用いた「384法」による胚様体形成を行い、心筋への分化を評価したところ、ハンギングドロップ法と同様に心筋細胞を生ずることが明らかとなった。

結論

ＥＳ細胞の血清除去による心筋への効率的分化誘導と、網羅的発現遺伝子の探索により心筋および心筋前駆細胞で発現する候補マーカーＸを同定することができた。胚様体には心筋の他に心内膜細胞等が生じていることが示唆され、ネガティブセレクションによる単離も有用であると考えられた。EB形成チップ法など新規デバイスを用いた方法により、従来法よりも省スペース省労力で胚様体形成が可能であることを確認した。

公開日・更新日

• 公開日: 2008-04-10
• 更新日: -