ヒト肝３次元培養系、マウス・ヒト肝細胞融合系による新規医薬品毒性評価系に関する基盤研究

文献情報

文献番号
200708002A
報告書区分
総括
研究課題名
ヒト肝３次元培養系、マウス・ヒト肝細胞融合系による新規医薬品毒性評価系に関する基盤研究
課題番号
H17-トキシコ-一般-002
研究年度
平成19(2007)年度
研究代表者(所属機関)
小澤　正吾(岩手医科大学薬学部)
研究分担者(所属機関)
  • 石田　誠一(国立医薬品食品衛生研究所薬理部)
  • 宮島　敦子(国立医薬品食品衛生研究所薬理部)
研究区分
厚生労働科学研究費補助金 厚生科学基盤研究分野 創薬基盤推進研究（トキシコゲノミクス研究）
研究開始年度
平成17(2005)年度
研究終了予定年度
平成19(2007)年度
研究費
14,800,000円
研究者交替、所属機関変更
-

研究報告書（概要版）

研究目的
医薬品有害事象発現に関連する薬物代謝酵素誘導能評価可能な細胞培養系を構築する。健常ヒト肝mRNAの遺伝子発現の模倣を目指し、薬物代謝酵素の構成的発現ならびに誘導の機序を明らかにする。
研究方法
ヒト肝癌細胞株HepG2を平面培養、三次元培養した。対数増殖期細胞を薬剤（rifampicin 100 μM、dexamethasone 10μMAphenobarbital 250μM）に3日間暴露した。様々な条件下の細胞の遺伝子発現プロフィールを解析した。Paclitaxelで microtubuleを安定化させ、薬物代謝関連遺伝子の発現への影響を調べた。獨協医科大学およびHS研究資源バンクより供給された、転移性肝癌患者・非腫瘍部位30例につきCYP3A、PXR, CAR、RXRA mRNA発現量を定量した。これら遺伝子の候補miRNAを検索し、TaqMan Micro RNA Assay probeを用いてmiRNA発現量を測定した。ヒト肝組織の使用に係る倫理面への配慮を適正に行った。
結果と考察
薬物代謝関連遺伝子GAD1、CYP2B6、GSTP1、NAT2、GSTA3、SNN、SRD5A2、CHST1の発現が三次元培養環境下で3倍以上上昇した。Rifampicin、dexamethasone、phenobarbitalによりCYP3A4/5が誘導された。“細胞周期”、“コレステロール合成”、“細胞骨格”関連遺伝子、肝実質細胞のマーカーCK8が発現上昇した。CYP2B6、ABCC1、CYP3A4につきpaclitaxel処理濃度に依存して発現が上昇した。rifampicinによるCYP3A4誘導がさらに亢進した。CYP3A4遺伝子の発現量と正の相関を示すmiRNAと負の相関を示すmiRNAが存在し、CYP3A4の発現制御に関して異なる作用を示す可能性が示唆された。
結論
１．三次元培養環境では、薬物代謝動態関連遺伝子発現が高まり、“細胞周期”、“コレステロール合成”、“細胞骨格”に関連、肝実質・胆管上皮細胞マーカー遺伝子の発現上昇をみた。
２．microtubuleを安定化により、薬物代謝関連遺伝子であるCYP3A4、CYP2B6、ABCC1の発現上昇、rifampicinによるCYP3A4の誘導亢進を認めた。
３．CYP3A4の発現制御機構が異なるmiRNAの存在が示唆された。

公開日・更新日

公開日
2008-04-10
更新日
-

文献情報

文献番号
200708002B
報告書区分
総合
研究課題名
ヒト肝３次元培養系、マウス・ヒト肝細胞融合系による新規医薬品毒性評価系に関する基盤研究
課題番号
H17-トキシコ-一般-002
研究年度
平成19(2007)年度
研究代表者(所属機関)
小澤　正吾(岩手医科大学薬学部)
研究分担者(所属機関)
  • 石田　誠一(国立医薬品食品衛生研究所)
  • 宮島　敦子(国立医薬品食品衛生研究所)
研究区分
厚生労働科学研究費補助金 厚生科学基盤研究分野 創薬基盤推進研究（トキシコゲノミクス研究）
研究開始年度
平成17(2005)年度
研究終了予定年度
平成19(2007)年度
研究者交替、所属機関変更
-

研究報告書（概要版）

研究目的
医薬品有害事象発現に関連する薬物代謝酵素誘導能評価可能な細胞培養系を構築する。健常ヒト肝mRNAの遺伝子発現の模倣を目指し、薬物代謝酵素の構成的発現ならびに誘導の機序を明らかにする。
研究方法
ヒト肝癌細胞株HepG2を平面培養、三次元培養した。対数増殖期・定常期細胞の遺伝子発現プロフィールを解析した。対数増殖期細胞をrifampicin、dexamethasone、phenobarbitalに3日間暴露し、CYP3A等の誘導を測定した。Microtubuleと、薬物代謝関連遺伝子の発現の関連を調べた。阻害剤を用い、DNAメチル化、ヒストンアセチル化とCYP3A関連遺伝子の発現調節機構を解析した。獨協医科大学およびHS研究資源バンクより供給された転移性肝癌患者・非腫瘍部位30例につきCYP3A、ならびに関連遺伝子のmRNA、miRNAの発現量を測定した。ヒト肝組織の使用に係る倫理面への配慮を適正に行った。
結果と考察
HepG2細胞の三次元培養系で細胞の対数増殖期でrifampicin、dexamethasone、phenobarbitalによりCYP3A4/5 が誘導された。細胞の三次元培養環境下で薬物代謝関連遺伝子の構成的発現が上昇した。”血管内皮細胞増殖因子等発癌関連遺伝子”、“細胞周期”、“コレステロール合成”、“細胞骨格”関連遺伝子がCYP3Aの誘導ならびに構成的発現に重要であった。Microtubule安定化剤paclitaxel処理濃度に依存して発現が上昇し、rifampicinによるCYP3A4誘導がさらに亢進した。CYP3A4の発現制御に関して異なる作用を示すmiRNAの存在の可能性が示唆された。
結論
１．三次元培養環境では、対数増殖期細胞の薬物代謝動態関連遺伝子発現誘導が見られること、薬物動態関連遺伝子の構成的発現が高まることが見出された。これらの現象には、”発癌関連遺伝子”、“細胞周期”、“コレステロール合成”、“細胞骨格”関連遺伝子、肝実質・胆管上皮細胞マーカー遺伝子の発現が随伴した。
２．Microtubule安定化剤paclitaxel処理によりCYP3A等の発現が上昇し、これら遺伝子発現と細胞骨格との関連が示唆された。
３．DNAメチル化、ヒストンアセチル化がCYP3A発現に重要と思われた。
４．CYP3A4の発現制御機構が異なるmiRNAの存在が示唆された。

公開日・更新日

公開日
2008-04-10
更新日
-

行政効果報告

文献番号
200708002C

成果

専門的・学術的観点からの成果
HepG2細胞の三次元培養系でリファンピシン、デキサメサゾン、フェノバルビタールにより対数増殖期細胞のCYP3A4/5 が誘導された。薬物代謝関連遺伝子の構成的発現が上昇した。血管内皮細胞増殖因子等発癌関連遺伝子、細胞周期、コレステロール合成、細胞骨格関連遺伝子がCYP3Aの誘導ならびに構成的発現に重要であった。チューブリン安定化剤処理でCYP3A4発現上昇、リファンピシンによるCYP3A4誘導亢進がみられた。CYP3A4の発現制御に関して異なる作用を示すmiRNAの存在が示唆された。
臨床的観点からの成果
本系は、臨床試料を用いたものではないが、ヒト肝の遺伝子発現プロフィールを部分的に模倣した。ヒト初代培養肝細胞の遺伝子発現プロフィールと比較し、類似した点に着目して医薬品等の有害事象の予測に応用できる可能性が大いにある。
ガイドライン等の開発
本系により、医薬品開発候補品としては一般的に好ましくない薬物代謝酵素誘導能を評価することができる。ガイドライン等の開発に生かすためには、汎用性、ならびにヒト肝細胞の代替性をさらに検証する必要があると考えられる。
その他行政的観点からの成果
新規細胞培養基材や培養方法を採用しヒト肝癌細胞を種々の新規培養環境に置くことにより、健常ヒト肝mRNAの遺伝子発現を模倣する安定培養系を確立した。薬物代謝動態関連遺伝子の誘導を安定かつ再現性高く評価できた。薬物代謝酵素遺伝子の構成的発現の上昇も認められ、新規医薬品開発候補品の安全性評価系として有用な系を確立した。
その他のインパクト
分担研究者の石田らは、第一回アジア太平洋国際薬物動態学会において、シンポジウムH4. 「第I相薬物代謝酵素の発現調節」において、招聘講演を行った。
S. Ishida, T. Hongo, S. Ozawa, et al., “Regulation of genes associated with liver function in 3-dimensional culture systems of human liver cells”. 2006年5月26日

発表件数

原著論文（和文）
0件
原著論文（英文等）
1件
その他論文(和文)
0件
その他論文(英文等)
0件
学会発表(国内学会)
2件
学会発表(国際学会等)
6件
その他成果(特許の出願)
0件
「出願」「取得」計0件
その他成果(特許の取得)
0件
その他成果(施策への反映)
0件
その他成果(普及・啓発活動)
0件

特許

主な原著論文20編（論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限る）

論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限ります。

原著論文1
T.Hongo, S. Ishida, S. Ozawa, et al.
Gene expression property of high density three dimensional tissue of HepG2 formed in radial-flow bioreactor.
Journal of Bioscience and Bioengineering , 101 (3) , 243-250  (2006)

公開日・更新日

公開日
2015-05-26
更新日
-