コンフォメーション特異的抗体による簡便で高精度なＢＳＥ診断法の開発研究

文献情報

• 文献番号: 200636032A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: コンフォメーション特異的抗体による簡便で高精度なＢＳＥ診断法の開発研究
• 課題番号: H17-食品-若手-016
• 研究年度: 平成18(2006)年度
• 研究代表者(所属機関): 橋口 周平(鹿児島大学工学部)
• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 健康安全確保総合研究 食品の安心・安全確保推進研究
• 研究開始年度: 平成17(2005)年度
• 研究終了予定年度: 平成18(2006)年度
• 研究費: 3,000,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

プリオン病の診断は現在、プロテアーゼ処理後に、試料中に残ったプリオン蛋白を検出する方法が利用されているが、感染性プリオンだけに直接結合する抗体を作製することは、診断法の簡便化、生前診断を確立する上で重要である。本研究では、プリオンの直接検出によるプリオン病の診断法を確立するため、ヒト抗体ファージライブラリーを用いて、感染性プリオンのコンフォメーションを識別する抗体を作製することを具体的達成目標とした。

研究方法

遺伝子組み換えプリオン蛋白 (aa23-231) からβシート型プリオン蛋白およびプリオン蛋白フィブリルを作製し、抗体ファージライブラリと直接反応させることで、プリオン蛋白の構造を識別できる抗体を単離する。標的となるプリオン蛋白の立体構造は透過型電子顕微鏡、原子間力顕微鏡、CDスペクトル解析によりそのコンフォメーションを確認した。

結果と考察

遺伝子組み換えヒトプリオン分子（aa23-231）からプリオン蛋白フィブリルを作製、電子顕微鏡解析および原子間力顕微鏡解析によりその線維化を確認した。作製したプリオン蛋白フィブリルはプロテアーゼ抵抗性を示した。プリオン蛋白フィブリルとヒト抗体ファージライブラリを用いてパンニングを行い、プリオン蛋白フィブリル特異的ヒト一本鎖抗体を単離した。これらの抗体ファージは、プリオン蛋白フィブリルには結合するが、α-PrP、β-PrPとの反応性は認められなかった。単離された抗体ファージは、プリオン蛋白オリゴマーとは異なるプリオン蛋白フィブリルに特有の構造を特異的に認識していることが示唆された。

結論

抗体ファージライブラリを用いたパンニング法でコンフォメーションをスナップショットできる抗体を作製できることを明らかにした。

公開日・更新日

• 公開日: 2007-07-23
• 更新日: -

文献情報

• 文献番号: 200636032B
• 報告書区分: 総合
• 研究課題名: コンフォメーション特異的抗体による簡便で高精度なＢＳＥ診断法の開発研究
• 課題番号: H17-食品-若手-016
• 研究年度: 平成18(2006)年度
• 研究代表者(所属機関): 橋口 周平(鹿児島大学工学部)

研究分担者(所属機関)

• 杉村　和久(鹿児島大学工学部 )
• 伊東　祐二(鹿児島大学工学部 )

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 健康安全確保総合研究 食品の安心・安全確保推進研究
• 研究開始年度: 平成17(2005)年度
• 研究終了予定年度: 平成18(2006)年度
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

本研究では、異常プリオンに特異的抗体を用いることで直接同定、検出、定量する方法を確立する目的で、感染性、病原性と関連した構造に特異的な抗体の作製を試みた。

研究方法

遺伝子組み換えプリオン蛋白 (aa23-231) からβシート型プリオン蛋白およびプリオン蛋白フィブリルを作製し、抗体ファージライブラリと直接反応させることで、プリオン蛋白の構造を識別できる抗体を単離する。標的となるプリオン蛋白の立体構造は透過型電子顕微鏡、原子間力顕微鏡、CDスペクトル解析によりそのコンフォメーションを確認した。

結果と考察

２０名のヒト末梢血リンパ球より調製したヒト一本鎖抗体（scFv）抗体ライブラリーと遺伝子組み換えヒトプリオン蛋白（aa23-231）を用いて、ヒトおよびウシプリオン蛋白に特異的なヒト抗体を単離した。またin vitroリフォールディングによりβシート構造のプリオン蛋白オリゴマー(β-PrP)、およびプリオン蛋白フィブリルを作製し抗体のスクリーニングを行った。その結果、β-PrP を用いたパンニングからは、β-PrPに特異的に結合するが、ネイティブな構造のプリオン蛋白には反応しない、β-PrP特異的ヒト一本鎖抗体が単離された。また、プリオン蛋白フィブリルを用いたパンニングからは、プリオン蛋白フィブリルに特異的に結合するが、α-PrP、β-PrPには反応性を示さない抗体ファージを単離した。これらの抗体は、プリオン蛋白オリゴマーおよびプリオン蛋白フィブリルに特有の構造を特異的に認識していることが示唆された。

結論

抗体ファージライブラリを用いたパンニング法でコンフォメーションをスナップショットできる抗体を作製できることを明らかにした。感染性、病原性と関連した構造に特異的な抗体の選別を試み、直接同定、検出、定量する方法を確立する。

公開日・更新日

• 公開日: 2007-04-13
• 更新日: -

行政効果報告

• 文献番号: 200636032C

成果

• 専門的・学術的観点からの成果: ヒトプリオン分子 (aa23-231) のin vitro リフォールディングにより、βシート型プリオン蛋白、プリオン蛋白フィブリルを作製、透過型電子顕微鏡、原子間力顕微鏡、CDスペクトル解析によりそのコンフォメーションを確認後、抗体ファージライブラリーと直接反応させることで、プリオン蛋白分子のコンフォメーションをスナップショットする特異的抗体を作製できることを明らかにした。
• 臨床的観点からの成果: 作製されたプリオン蛋白のコンフォメーション特異的抗体が、実際の感染材料中の異常プリオンを直接識別できるかどうかを決定することが残された課題であり、感染性、病原性と関連した構造に特異的な抗体の選別を試みている。
• ガイドライン等の開発: なし
• その他行政的観点からの成果: なし
• その他のインパクト: なし

発表件数

• 原著論文（和文）: 0件
• 原著論文（英文等）: 0件
• その他論文(和文): 0件
• その他論文(英文等): 1件
• 学会発表(国内学会): 5件
• 学会発表(国際学会等): 3件
• その他成果(特許の出願): 0件 ; 「出願」「取得」計0件
• その他成果(特許の取得): 0件
• その他成果(施策への反映): 0件
• その他成果(普及・啓発活動): 0件

公開日・更新日

• 公開日: 2013-05-27
• 更新日: -