文献情報
文献番号
200614088A
報告書区分
総括
研究課題名
HIV-1およびインフルエンザウイルスのゲノムRNA核外輸送機構の解明に基づく創薬
課題番号
H16-創薬-107
研究年度
平成18(2006)年度
研究代表者(所属機関)
高橋 秀宗(国立感染症研究所)
研究分担者(所属機関)
- 飛梅 実(国立感染症研究所 )
- 松田道行(京都大学大学院医学研究科)
- 森山雅美(イムノヘルスジャパン)
- 山口靖雄(大道産業)
研究区分
厚生労働科学研究費補助金 厚生科学基盤研究分野 政策創薬総合研究
研究開始年度
平成16(2004)年度
研究終了予定年度
平成18(2006)年度
研究費
9,000,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書(概要版)
研究目的
HIV-1のゲノムRNAの核外輸送を含む複製を蛍光共鳴エネルギー移動 (FRET)を応用した分子プローブを使って観察し、新規抗ウイルス薬開発の標的としていくことを目的とした。
研究方法
①Crm1により核外輸送されることが知られているセリンスレオニンチロシンリン酸化酵素MEKを内在性コントロールとして用いた。
②Rev-Crm1の会合によって誘導されるFRETに対する恒常活性化型Ranの影響を調べた。
③恒常活性化型Ranによって誘導された高いFRET値に対する、Revの核外移行阻害因子TTP101の影響を調べた。
④Rev発現細胞のすべてにおいて恒常活性化型Ranを発現させるため、CFP-RevのcDNA下流にIRES配列を挿入し、その下流に恒常活性化型Ran cDNAを挿入した。
②Rev-Crm1の会合によって誘導されるFRETに対する恒常活性化型Ranの影響を調べた。
③恒常活性化型Ranによって誘導された高いFRET値に対する、Revの核外移行阻害因子TTP101の影響を調べた。
④Rev発現細胞のすべてにおいて恒常活性化型Ranを発現させるため、CFP-RevのcDNA下流にIRES配列を挿入し、その下流に恒常活性化型Ran cDNAを挿入した。
結果と考察
①MEKを内在性コントロールとしておくことより、Revに特異的に作用する薬剤がスクリーニングできるようになった。
②Rev-Crm1の会合によって誘導されるFRETは恒常活性化型Ranによって2倍近く増強されることが確認した。
③恒常活性化型Ran存在下ではレプトマイシンBによるFRETの減弱は認められなかったが、Revの核外移行阻害因子であるTTP101存在下ではFRET値が減衰した。
④Revと恒常活性化型Ranを同じベクターから発現させることによりRevとCrm1の会合に由来する高いFRET値を得ることができた。
恒常活性化型Ran存在下では、既存のCrm1阻害剤であるレプトマイシンBを用いてもFRETの減衰が認められなかった。RevとCrm1の結合阻害ではないため、FRETの減衰が認められないものと推察した。一方TTP101はRevの核外移行を抑制する因子であり、FRET値を減衰させたため、開発したRev-Crm1の会合をモニターするプローブは恒常活性化型Ran存在下でもRevの機能阻害を評価できる系であることが明らかとなった。
CFP-Revと恒常活性化型Ranを同じベクターから発現させることによりRevとCrm1の会合に由来する高いFRET値を得られた。
②Rev-Crm1の会合によって誘導されるFRETは恒常活性化型Ranによって2倍近く増強されることが確認した。
③恒常活性化型Ran存在下ではレプトマイシンBによるFRETの減弱は認められなかったが、Revの核外移行阻害因子であるTTP101存在下ではFRET値が減衰した。
④Revと恒常活性化型Ranを同じベクターから発現させることによりRevとCrm1の会合に由来する高いFRET値を得ることができた。
恒常活性化型Ran存在下では、既存のCrm1阻害剤であるレプトマイシンBを用いてもFRETの減衰が認められなかった。RevとCrm1の結合阻害ではないため、FRETの減衰が認められないものと推察した。一方TTP101はRevの核外移行を抑制する因子であり、FRET値を減衰させたため、開発したRev-Crm1の会合をモニターするプローブは恒常活性化型Ran存在下でもRevの機能阻害を評価できる系であることが明らかとなった。
CFP-Revと恒常活性化型Ranを同じベクターから発現させることによりRevとCrm1の会合に由来する高いFRET値を得られた。
結論
MEKを内在性コントロールとしておくことより、Revに特異的に作用する薬剤がスクリーニングできるようになった。また恒常活性化型Ranの存在によりFRET値を高めることができた。実際にRevの核外移行抑制因子によりRevの機能阻害を評価できる系であることを示した。恒常活性化型RanをRevと同じベクターから発現させることによりRevとCrm1の高いFRET値を得た。
公開日・更新日
公開日
2007-04-16
更新日
-