文献情報
文献番号
200614073A
報告書区分
総括
研究課題名
再生医療を目的としたアデノウイルスベクターによるES細胞への効率的な遺伝子導入・発現系の開発
課題番号
H16-創薬-089
研究年度
平成18(2006)年度
研究代表者(所属機関)
川端 健二(独立行政法人医薬基盤研究所)
研究分担者(所属機関)
研究区分
厚生労働科学研究費補助金 厚生科学基盤研究分野 政策創薬総合研究
研究開始年度
平成16(2004)年度
研究終了予定年度
平成18(2006)年度
研究費
3,000,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書(概要版)
研究目的
ES 細胞を目的の細胞に分化させるには胚葉体(embryoid body; EB) とよばれる中間体を介する。昨年、アデノウイルス (Ad) ベクターを用いた EB への高効率遺伝子導入法について報告した。そこで、本年度はこの Ad ベクターを用いて EB に機能遺伝子を導入することにより、目的の細胞に効率よく分化させることが可能かどうかについて検討した。
研究方法
E14 マウス ES 細胞は LIF 含有培地にてフィーダー細胞上で培養し、3-5 日ごとに継代した。EB はハンギングドロップ法により作製した。Adベクターの作成は improved in vitro ライゲーション法により行った。Ad ベクターによる遺伝子導入は 2日間ハンギングドロップを行うことでES細胞からEBを形成させ、その後3日間浮遊培養したDay5 EBに対して10,000 VP/cellの濃度でAd ベクターを1.5 時間作用させ、遺伝子発現を解析した。脂肪細胞への分化誘導はハンギングドロップを2日間行ってEBを形成させ、続いて3日間all-trans-retinoic acid (RA)含有培地で培養した。その後RAを除いた培地で2日浮遊培養して、7日目にゼラチンコートした12穴プレートに4EB/wellで播種して分化誘導培地で培養した。
結果と考察
RSV、CMV、CA、EF-1α各 4種のプロモーターを有する LacZ 発現 Ad ベクターを、ハンギングドロップ後 5 日目の EB に対して作用させた結果、CA プロモーターを有した Ad ベクターを作用させた場合に最も高い遺伝子発現を示し、EB には CA プロモーターを有する Ad ベクターが最適であることが示された。脂肪細胞分化のマスターレギュレーターである PPARγ遺伝子を Ad ベクターを用いて EB に導入し、ES 細胞から脂肪細胞に分化させた結果、従来の脂肪細胞分化誘導法と比較し効率良く脂肪細胞へと分化誘導できることが示された。今後、この技術を用いて他の機能遺伝子を導入することにより、血液細胞や骨芽細胞などにも分化させることが可能であると考えられ、再生医療への応用に向けたさらなる研究進展が望まれる。
結論
(1)最適化された Ad ベクターを用いることにより、EB に対し高効率に遺伝子導入できることが明らかとなった。
(2)最適化された Ad ベクターを用いて PPARγ遺伝子を EB に導入することにより、効率よく脂肪細胞に分化させることが可能であった。
(2)最適化された Ad ベクターを用いて PPARγ遺伝子を EB に導入することにより、効率よく脂肪細胞に分化させることが可能であった。
公開日・更新日
公開日
2007-04-02
更新日
-