バイオテクノロジーによるワクチンの創製と改良技術の開発

文献情報

• 文献番号: 200614050A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: バイオテクノロジーによるワクチンの創製と改良技術の開発
• 課題番号: H16-創薬-058
• 研究年度: 平成18(2006)年度
• 研究代表者(所属機関): 松浦 善治(大阪大学)

研究分担者(所属機関)

• 森石　恆司(大阪大学微生物病研究所分子ウイルス分野)
• 鈴木　哲朗(国立感染症研究所ウイルス第２部)
• 伊丹　清馬(三菱ウェルファーマ株式会社)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 厚生科学基盤研究分野 政策創薬総合研究
• 研究開始年度: 平成16(2004)年度
• 研究終了予定年度: 平成18(2006)年度
• 研究費: 4,500,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

水疱性口内炎ウイルス(VSV)のエンベロープ遺伝子を欠損させ、代わりにHCVのエンベロープ遺伝子を組み込んだ組換えVSV(HCVrv)を作製し、HCVの感染複製過程を解析し、その成績を基にした抗ウイルス剤や治療用ワクチンの開発を試みる。また、弱毒化されたワクチニアウイルスであるDIs株のワクチンベクターとしての有用性を検討するとともに、Cyclosporine A類似化合物のPPIase活性を指標にして、抗HCV薬の探索することを目的とする。

研究方法

1) HCVエンベロープ遺伝子を、VSVのエンベロープ遺伝子を欠損させたVSVのcDNAに挿入し、HCVrvを各種動物細胞で作製した。2) SARS-CoVの構造蛋白遺伝子を組み込んだ弱毒化ワクチニアウイルス(DIs)を取得した。3) PPIase活性阻害を指標にした抗HCV候補化合物をスクリーニングした。

結果と考察

1) HCVrvは293TやHuh7細胞で作製すると感染性を示すウイルスが得られ、これらのウイルスはHuh7細胞に最も高い感染性を示した。HCVrvの作製は37℃よりも、30℃で培養した方が高い感染価のウイルスが得られた。また、293TやHuh7細胞で作製したHCVrvは、抗hCD81抗体やＣ型肝炎患者血清で中和された。さらに、Huh7細胞では感染の拡大が観察された。2) SARS-CoVの構造蛋白を発現する各種組換えDIsを経鼻あるいは皮下接種されたマウスはSARS-CoVを認識する抗体が誘導されていた。SARS-CoVのS蛋白質を発現する組換えウイルスを接種されたマウス血清は、in vitroでSARS-CoVの感染を中和した。この組換えDIsは、重症肺炎のモデルマウスに接種した場合、発症を完全に抑制する効果があることが示され、ワクチンとして極めて有効であることが証明された。3) PPIase活性の阻害を指標にして化合物を評価したが、阻害活性を示す化合物は確認できなかった。

結論

1) 自立増殖可能なHCVrvは、各種遺伝子型のHCVの感染機構の解析に有用である。2) SARS-CoVのS蛋白を発現するDIsは重症肺炎モデル系で発症を完全に抑制することから、ワクチンとして極めて有効である。3) PPIase活性を阻害する化合物は確認できなかった。

公開日・更新日

• 公開日: 2007-04-02
• 更新日: -

文献情報

• 文献番号: 200614050B
• 報告書区分: 総合
• 研究課題名: バイオテクノロジーによるワクチンの創製と改良技術の開発
• 課題番号: H16-創薬-058
• 研究年度: 平成18(2006)年度
• 研究代表者(所属機関): 松浦 善治(大阪大学)

研究分担者(所属機関)

• 森石　恆司(大阪大学微生物病研究所分子ウイルス分野)
• 鈴木　哲朗(国立感染症研究所ウイルス第二部)
• 伊丹　清馬(三菱ウェルファーマ株式会社創薬第四研究所)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 厚生科学基盤研究分野 政策創薬総合研究
• 研究開始年度: 平成16(2004)年度
• 研究終了予定年度: 平成18(2006)年度
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

C 型肝炎ウイルス(HCV)の感染複製過程を解析し、その成績を基にした抗ウイルス剤や治療用ワクチンの開発を目的とする。

研究方法

1) HCVのエンベロープ蛋白質を被ったシュードタイプVSV(HCVpv)を作製した。2) HCVのエンベロープ遺伝子を組み込んだ組換えVSV (HCVrv)を各種動物細胞で作製した。3) SARS-CoV株HKU39849からクローニングされた各構造蛋白遺伝子を組み込んだ組換えDIsを作製し、へマウスに皮下あるいは経鼻接種し、SARS-CoV構造蛋白に対する液性、細胞性および粘膜免疫の誘導能を検討した。4) Cyclophilinをキモトリプシン共存下でインキュベートし、そこに基質ペプチドである suc-Ala Ala Pro Phe-MCAを添加し、ペプチドの切断を指標にPPIaseの活性を評価した。

結果と考察

1) 293T細胞で作製したHCVpvはレトロウイルスで作製したシュードタイプと同様にhCD81依存的な感染指向性を示し、CHO細胞で作製するとhFGFR5依存的に感染することが示された。また、Ｃ型肝炎患者血清中にも同様な親和性を示すHCV粒子が存在することが示された。 2) HCVrvはhCD81依存的な感染性を示し、感染を拡大していることが確認された。3) 高度弱毒化ワクチニアウイルスDIs株は約40年前に副作用のない種痘の候補としてヒトへの投与実験も行われており、安全性の高さはすでに確認されている。4) SARS-CoVのS蛋白質を発現する組換えDIsにはSARS発症を抑制する効果があることが示され、この組換えウイルスはワクチンとして有効であることが証明された。5) Cyclophilinを大腸菌で発現しPPIase阻害活性を評価したが阻害活性を示す化合物は得られなかった。

結論

1) Ｃ型肝炎患者の体内には少なくとも、hCD81やhFGFR5に親和性を示すHCVが産生されている可能性が示唆された。2) 自立増殖可能なHCVrvは、各種遺伝子型のHCVの感染機構の解析に有用である。3) 組換えDIsは効率よく液性、細胞性及び粘膜免疫を誘導できるベクターである。4) PPIase活性を阻害する化合物は確認できなかった。

公開日・更新日

• 公開日: 2007-04-02
• 更新日: -

行政効果報告

• 文献番号: 200614050C

成果

• 専門的・学術的観点からの成果: HCVの感染・複製に関与する宿主因子の解析で、CD81以外の受容体候補分子としてFGFR5を、また、複製に必須な宿主因子として、VAP-B, FKBP8およびHsp90を同定できた意義は大きい。これらの因子を標的とした抗HCV薬の開発も可能と思われる。
• 臨床的観点からの成果: 本研究で得られた成果を基に、今後は感染細胞からHCVを排除できる、治療用ワクチンの開発を進めたい。
• ガイドライン等の開発: 特になし。
• その他行政的観点からの成果: 特になし。
• その他のインパクト: HCVの複製に必須な宿主因子として、 FKBP8とHsp90を同定したが、この成果は朝日新聞で紹介された。

発表件数

• 原著論文（和文）: 0件
• 原著論文（英文等）: 24件
• その他論文(和文): 0件
• その他論文(英文等): 0件
• 学会発表(国内学会): 35件
• 学会発表(国際学会等): 19件
• その他成果(特許の出願): 0件 ; 「出願」「取得」計3件
• その他成果(特許の取得): 0件
• その他成果(施策への反映): 0件
• その他成果(普及・啓発活動): 0件

主な原著論文20編（論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限る）

• 原著論文1: Miyamoto H., Moriishi K., Moriya K., et al ; Involvement of PA28γ-dependent pathway in insulin resistance induced by hepatitis C virus core protein.; J. Virol. , 81 , 1727-1735 (2007)
• 原著論文2: Shirakura M., Murakami K., Ichimura T., et al; The E6AP ubiquitin ligase mediates ubiquitylation and degradation of hepatitis C virus core protein. ; J. Virol. , 81 , 1174-1185 (2007)
• 原著論文3: Nakai K., Okamoto T., Kimura-Someya T.,et al; Oligomerization of hepatitis C virus core protein is crucial for interaction with cytoplasmic domain of E1 envelope protein. ; J. Virol. , 80 , 11265-11273 (2006)
• 原著論文4: Okamoto T. Nishimura Y., Ichimura T., et al; Hepatitis C virus RNA replication is regulated by FKBP8 and Hsp90. ; EMBO J. , 25 , 5015-5025 (2006)
• 原著論文5: Ishii K., Iijima S., Kimura N., et al; GBV-B as a pleiotropic virus: Distribution of GBV-B in extrahepatic tissues in vivo. ; Microbes and Infection (2007)
• 原著論文6: Mizutani T., Fukushi S., Kenri T., ; Mechanisms of establishment of persistent SARS-CoV-infected cells. ; Archives of Virology (2007)
• 原著論文7: Mizutani T., Endoh D., Shirato K., et al; System for rapid determination of viral RNA sequence by ligation-mediated amplification and direct sequencing technology for emerging viral infectious diseases. ; Emerging Infectious Diseases , 13 , 322-324 (2007)
• 原著論文8: Matsuyama S., Ujike M., Ishii K., et al; Enhancement of SARS-CoV infection by proteases. ; Adv. Exp. Med. Biol. , 581 , 253-258 (2006)
• 原著論文9: Ishii K., Hasegawa H., Nagata N., et al; Highly attenuated vaccinia virus DIs as a potential SARS vaccine. ; Adv. Exp. Med. Biol. , 581 , 593-596 (2006)
• 原著論文10: Mizutani T., Fukushi S., Ishii K., et al; Mechanisms of establishment of persistent SARS-CoV-infected cells.; Biochemical and Biophysical Research Communications , 347 , 261-265 (2006)
• 原著論文11: Murakami K., Ishii K., Ishihara Y., et al; Production of infectious hepatitis C virus particles in three-dimensional cultures of the cell line carrying the genome-length dicistronic viral RNA of genotype 1b. ; Virology , 351 , 381-392 (2006)
• 原著論文12: Ishii K., Hasegawa H., Nagata N., et al; Induction of Protective Immunity against Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus (SARS-CoV) Infection using Highly Attenuated Recombinant Vaccinia Virus DIs.; Virology , 351 , 368-380 (2006)
• 原著論文13: Hamamoto I, Nishimura Y, Okamoto T, et al; Human VAP-B Is Involved in Hepatitis C Virus Replication through Interaction with NS5A and NS5B.; J. Virol. , 79 , 13473-13482 (2005)
• 原著論文14: Li TC, Takeda N, Miyamura T., et al; Essential elements of the capsid protein for self-assembly into empty virus-like particles of hepatitis E virus.; J. Virol. , 79 , 12999-13006 (2005)
• 原著論文15: Abe T, Hemmi H, Moriishi K, et al; Involvement of the toll-like receptor 9 signaling pathway in the induction of innate immunity by baculovirus. ; J. Virol. , 79 , 2847-2858 (2005)
• 原著論文16: Kitagawa Y, Tani H, Limn CK, et al; Ligand-directed gene targeting to mammalian cells by pseudotype baculoviruses.; J. Virol. , 79 , 3639-3652 (2005)
• 原著論文17: Mori Y, Okabayashi T, Yamashita T, et al; Nuclear localization of Japanese encephalitis virus core protein enhances viral replication. ; J. Virol. , 79 , 3448-3458 (2005)
• 原著論文18: Suzuki R, Sakamoto S, Tsutsumi T, et al; Molecular determinants for subcellular localization of hepatitis C virus core protein.; J. Virol. , 79 , 1271-1281 (2005)
• 原著論文19: Okamoto K., Moriishi K., Miyamura T., et al; Intramembrane proteolysis and ER retention of HCV core protein.; J. Virol. , 78 , 6370-6380 (2004)
• 原著論文20: Kaimori A., Kanto T., Limn C-K., et al; Pseudotype hepatitis C virus enters immature myeloid dendritic cells through the interaction with lectin.; Virology , 324 , 74-83 (2004)

公開日・更新日

• 公開日: 2015-05-26
• 更新日: -