ヒト肝細胞で置換された肝臓を持つマウスの医薬品開発への利用－非拘束マウスの胆汁採取分析技術の確立－

文献情報

• 文献番号: 200614032A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: ヒト肝細胞で置換された肝臓を持つマウスの医薬品開発への利用－非拘束マウスの胆汁採取分析技術の確立－
• 課題番号: H16-創薬-037
• 研究年度: 平成18(2006)年度
• 研究代表者(所属機関): 吉里 勝利(広島大学大学院理学研究科 生物科学専攻・動物科学講座)

研究分担者(所属機関)

• 堀江　透(㈱フェニックスバイオ)
• 小林　英司(自治医科大学　分子病態治療研究センター　臓器置換研究部)
• 絵野沢　伸(国立成育医療センター研究所　移植･外科研究部　)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 厚生科学基盤研究分野 政策創薬総合研究
• 研究開始年度: 平成16(2004)年度
• 研究終了予定年度: 平成18(2006)年度
• 研究費: 6,000,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

　ヒト肝細胞キメラマウスは、マウス肝臓の70%以上がヒト肝細胞で置換されており、置換されたヒト肝細胞は、薬物代謝に関わるヒト型酵素系をドナーと同様のレベルで発現している。医薬候補品の胆汁排泄動態や胆汁中代謝物をキメラマウスで同定出来れば、ヒトにおける薬物動態の予測が可能となるため、キメラマウスを用いた非拘束胆汁排泄試験モデルを確立することを目的とする。

研究方法

　本年度は昨年度に引き続き、非拘束胆汁回収装置及び技術の改良を行った。さらにキメラマウスの非拘束胆汁排泄モデルの有用性を示すため、非拘束胆汁回収装置に接続したキメラマウスに2種類の化合物を用いた投与試験を行った。

結果と考察

　開発した胆管カニュレーション施術を施したマウスに膵炎の兆候がみられたが、胆嚢カニュレーションで回収した胆汁と成分に変動はなかったため、短期間の胆汁回収には適用可能と思われる。　次に胆汁回収の安定化について装置と維持について検討を行った。装置とマウスの接続にハーネスを導入し、マウスの動きを緩衝するシーベルを吊るアームが振り子のように動く機構を加えたことで負荷が軽減され、さらに自由に動き回れるようになった。また、胆汁回収の維持については、施術には20 g以上のマウスを選定し、2日に1回、体外部のカニューレ交換をすることにより、キメラマウスから2週間以上安定的に胆汁回収をすることが可能となった。
　キメラマウスからの胆汁回収が安定的になったため、実際に非拘束状態のキメラマウスに化合物を投与して胆汁を回収し、親化合物および代謝物の分析を行った。ナテグリニドの投与試験では胆汁にヒト特異的な代謝物であるグルクロン酸抱合体が排泄されていることが確認された。また、キメラマウスに化合物を反復投与し、経時的に胆汁を採取することで単回投与時のときよりも大量にヒト特異的代謝物を回収できることが確認された。また、アトルバスタチンを投与した試験ではキメラマウスで投与翌日から7日目までアトルバスタチンが減少することが確認できたことから、ヒトで半減期の長い胆汁代謝物の回収がキメラマウスの非拘束胆汁回収モデルで可能であることがわかった。

結論

　非拘束胆汁回収装置に接続したキメラマウスへの化合物投与実験により、キメラマウスの非拘束胆汁排泄モデルは生理的条件下に近い状態でヒトの薬物動態を予測できる非常に優れたモデルであると考えられる。

公開日・更新日

• 公開日: 2007-04-17
• 更新日: -

文献情報

• 文献番号: 200614032B
• 報告書区分: 総合
• 研究課題名: ヒト肝細胞で置換された肝臓を持つマウスの医薬品開発への利用－非拘束マウスの胆汁採取分析技術の確立－
• 課題番号: H16-創薬-037
• 研究年度: 平成18(2006)年度
• 研究代表者(所属機関): 吉里 勝利(広島大学大学院理学研究科 生物科学専攻・動物科学講座)

研究分担者(所属機関)

• 堀江　透(㈱フェニックスバイオ)
• 小林　英司(自治医科大学　分子病態治療研究センター　臓器置換研究部)
• 絵野沢　伸(国立成育医療センター研究所　移植･外科研究部)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 厚生科学基盤研究分野 政策創薬総合研究
• 研究開始年度: 平成16(2004)年度
• 研究終了予定年度: 平成18(2006)年度
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

　ヒト肝細胞キメラマウスは、マウス肝臓の70%以上がヒト肝細胞で置換されており、置換されたヒト肝細胞は、薬物代謝に関わるヒト型酵素系をドナーと同様のレベルで発現している。医薬候補品の胆汁排泄動態や胆汁中代謝物をキメラマウスで同定出来れば、ヒトにおける薬物動態の予測が可能となるため、キメラマウスを用いた非拘束胆汁排泄試験モデルを確立することを目的とした。

研究方法

　キメラマウスの胆嚢にカニュレーションして胆汁を回収する方法を開発した。また、キメラマウスから胆汁が回収できる非拘束胆汁回収装置を開発した。さらにキメラマウスに化合物を投与し、この装置を用いて回収した胆汁中の親化合物及び代謝物の分析し、評価した。

結果と考察

　キメラマウスからの胆汁回収は、胆嚢にストッパー付きカニューレを挿入する手法をとることで確実となった。また、キメラマウスから継続的に胆汁を回収するため、マウスの動きに合わせて動くユニットを組み込んだ非拘束胆汁回収装置を開発した。これにより、2週間以上安定的に胆汁を回収することが可能となった。
　さらにキメラマウスから回収した胆汁の組成をヒト胆汁と比較した。胆汁にヒトアルブミンが高濃度に存在し、マウス胆汁には存在しないグリココール酸が検出されたため、置換されたヒト肝細胞が胆汁分泌機能を有することが示唆された。
　開発した非拘束胆汁排泄装置を用いてキメラマウスに化合物4種類を投与する試験を行った。S-warfarinの投与試験では、ヒトにおいて7位水酸化体が主要代謝物として生成するという報告と一致した。ジアゼパムを投与したキメラマウスから回収した胆汁をTLC分析したところ、代謝物よりも未変化体が多く排泄されていることから、ヒトではわずかながら腸肝循環していることが推察された。ナテグリニドの投与試験では胆汁にヒト特異的な代謝物であるグルクロン酸抱合体が確認された。また、化合物を反復投与し、経時的に胆汁を採取することで単回投与の場合よりも大量に代謝物を回収できることが確認できた。さらに、アトルバスタチンの投与試験ではヒトで半減期の長い代謝物の回収がキメラマウスの非拘束胆汁回収モデルで可能であることがわかった。

結論

　ヒトの代謝が解明されている化合物のキメラマウスへの投与実験からも本研究で開発したキメラマウスの非拘束胆汁排泄モデルはヒトの薬物動態を反映した胆汁を回収できる非常に優れたモデルであると考えられる。

公開日・更新日

• 公開日: 2007-04-17
• 更新日: -

行政効果報告

• 文献番号: 200614032C

成果

• 専門的・学術的観点からの成果: マウスの肝臓肝細胞をヒト肝細胞で置換する技術を確立し、このマウス（キメラマウス）から胆汁を採取するための技術開発を行った。その結果拘束することなくマウスから胆汁を２週間以上にわたって安定的に採取することが可能になった。モデル化合物を投与したマウスの胆汁の化学分析によってヒト特異的代謝物の存在を確認し、また長半減期の胆汁代謝物の回収も可能であることを示した。本研究はキメラマウスは胆汁においてもヒトの薬物動態を反映していることを示しておりこの動物の医薬品開発における有用性をより強固にするものである。
• 臨床的観点からの成果: 医薬品開発は、通常、１０年以上の期間と巨額の研究開発費を要しており、この軽減のための技術開発が求められている。医薬品開発の初期の段階から正常なヒト肝細胞をインビボで利用できればその軽減に大きな貢献ができる。私達は、ヒト肝細胞で構築された肝臓をもつマウス（キメラマウス）を安定的に作製する技術を確立した。このマウスの肝臓は各種化合物に対してヒト型代謝を行う。本研究は、胆汁代謝もヒト型であることを示しており、キメラマウスの医薬品開発における有用性をさらに強固にした。
• ガイドライン等の開発: なし
• その他行政的観点からの成果: なし
• その他のインパクト: ＜受賞＞; 2004年日経優秀製品･サービス賞（2005年1月5日） 日本経済新聞社; 第4回日本バイオベンチャー大賞・近畿バイオインダストリー振興会議賞（2005年10月19日）フジサンケイビジネスアイ; ; ＜テレビ放映＞; バイオベンチャー育成 （2007年3月9日）お好みワイド広島; ; ＜公開シンポジウム＞; 第二回フェニックスバイオ学術講演会 2005年10月7日 広島テクノプラザ

発表件数

• 原著論文（和文）: 0件
• 原著論文（英文等）: 11件
• その他論文(和文): 10件
• その他論文(英文等): 3件
• 学会発表(国内学会): 22件
• 学会発表(国際学会等): 5件
• その他成果(特許の出願): 0件 ; 「出願」「取得」計1件
• その他成果(特許の取得): 0件
• その他成果(施策への反映): 0件
• その他成果(普及・啓発活動): 0件

主な原著論文20編（論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限る）

• 原著論文1: Chise Tateno,Katsutoshi Yoshizato et al.; Near-completely humanized liver in mice shows human-type metabolic responses to drugs.; Am J Pathol , 165 , 901-912 (2004)
• 原著論文2: Miki Katoh,Katsutoshi Yoshizato and Tsuyoshi Yokoi et al.; Expression of Human CYPs in Chimeric Mice with Humanaized Liver.; Drug Metab Dispos , 32 , 1402-1410 (2004)
• 原著論文3: Masuhiro NISHIMURA,Katsutoshi YOSHIZATO, and Shinsaku NAITO et al.; Induction of Human CYP1A2 and CYP3A4 in Primary Culture of Hepatocytes from Chimeric Mice with Humanized Liver. ; Drug Metabolism and Pharmacokinetics , 20 (2) , 121-126 (2005)
• 原著論文4: Katoh, M., Yoshizato, K., and Yokoi, T. et al.; In vivo induction of human cytochrome P450 enzymes expressed in chimeric mice with humanized liver. ; Drug Metabolism and Disposition. , 33 , 754-763 (2005)
• 原著論文5: Nishimura, M.Yoshizato, K., and Naito, S. et al.; Induction of human CYP1A1 and CYP3A4 in primary culture of hepatocytes from chimeric mice with humanized liver.; Drug Metabol. Pharmacokin. , 20 , 121-126 (2005)
• 原著論文6: Tsuge, M.Yoshizato, K. et al.; Infection of human hepatocyte chimeric mouse which genetically engineered hepatitis B virus.; Hepatology , 42 , 1046-1054 (2005)
• 原著論文7: Katoh, M.Yoshizato, K., and Yokoi, T. et al.; Expression of human phase II enzymes in chimeric mice with humanized liver.; Drug Metabolism and Disposition. , 33 , 1333-1340 (2005)
• 原著論文8: Emoto K.,Yoshizato K. et al.; Efficient In Vivo Xenogeneic Retroviral Vector-Mediated Gene Transduction into Human Hepatocytes. ; HUMAN GENE THERAPY , 16 , 1138-1174 (2005)
• 原著論文9: Aoki, K. Yoshizato, K. et al.; Characterization of Humanized Liver from Chimeric Mice Using Coumarin as a Human CYP2A6 and Mouse CYP2A5 Probe.; Drug Metab.Pharmacokinet. , 21 , 277-285 (2006)
• 原著論文10: Miyamoto Y, Suzuki S, Nomura K, Enosawa S.; Improvement of hepatocyte viability after cryopreservation by supplementation of long-chain oligosaccharide in the freezing medium in rats and humans. ; Cell Transplantation , 15 (10) , 911-919 (2006)
• 原著論文11: Tokiwa T,Enosawa S, Tsukiyama T. et al.; Differentiation potential of an immortalized non-tumorigenic human liver epithelial cell line as liver progenitor cells.; Cell Biology International , 30 , 992-998 (2006)

公開日・更新日

• 公開日: 2015-05-26
• 更新日: -