ハイスループット・ヒト型遺伝毒性試験系の構築

文献情報

文献番号
200614031A
報告書区分
総括
研究課題名
ハイスループット・ヒト型遺伝毒性試験系の構築
課題番号
H16-創薬-036
研究年度
平成18(2006)年度
研究代表者(所属機関)
能美 健彦(国立医薬品食品衛生研究所 変異遺伝部)
研究分担者(所属機関)
  • 鎌滝哲也(高崎健康福祉大学健康福祉学部)
  • 林宏行(明治製菓株式会社)
  • 渡部一人(中外製薬株式会社)
  • 金谷一司(株式会社JIMRO)
  • 小田美光(大阪府公衆衛生研究所)
  • 須井 哉(食品薬品安全センター秦野研究所)
研究区分
厚生労働科学研究費補助金 厚生科学基盤研究分野 政策創薬総合研究
研究開始年度
平成16(2004)年度
研究終了予定年度
平成18(2006)年度
研究費
6,200,000円
研究者交替、所属機関変更
-

研究報告書(概要版)

研究目的
本研究班では、医薬品開発の初期に候補化合物の遺伝毒性、催奇形性を迅速に検出するハイ・スループット試験系を構築することを目的に、(1)ヒト遺伝子を導入した微生物遺伝毒性試験系(2)in vivo トランスジェニック(TG)ラット、TGマウス試験系を樹立する。
研究方法
ヒト薬物代謝酵素を発現させたumu試験の最適化を行った。改良法フラクチュエーションAmes試験(改良法FAT)の指標菌株として大腸菌DNA polymerase IV (Pol IV) を発現するサルモネラ株YG5161を用いた。Pol IV のヒト・ホモローグであるDNA polymerase kappa(hPol k)を用いて5種類の損傷部位の乗り越えDNA合成を行った。S.D.系gpt deltaラットにphenacetinを長期混餌投与し、発がん標的臓器(腎臓)での変異を同定した。短期発がん物質検出用Hras128ラットとgpt deltaラットを交配した。ヒトCYP3A7を発現する細胞を用いて、thalidomideによる催奇形性の機序を検討した。
結果と考察
ヒトCYP1A2を発現するサルモネラ株の感受性は、培養条件により影響を受けることを明らかにした。umu試験のキット化を進める際には、赤色の発色試薬(CPRG)が有用であることを示した。Ames試験では陽性であるが改良法FATでは陰性となった4化合物のうち2化合物がYG5161を指標菌株とすることにより陽性となった。hPol Kはベンツピレン、酸化損傷、アルキル化損傷を乗り越えてDNA合成を続けた。gpt delta肺由来GDL1細胞において内因性のマウスPol Kの発現を確認した。Phenacetinは腎臓においてもG:C to A:T変異を誘発した。ヒトHras遺伝子の導入はPhIPによって誘発される乳腺の変異感受性に影響を与えなかった。Thalidomideは胎児の四肢発生に重要な役割をはたす核内受容体RARを介した転写を抑制する可能性を示唆した。
結論
医薬品開発の初期に、迅速に遺伝毒性を検索するヒト型ハイ・スループット微生物試験菌系を確立し、そのキット化を進めた。TGラットおよびTGマウス細胞遺伝毒性試験系を樹立し、その最適化を行った。ヒトCYP3A7を発現する細胞を用い、thalidomideが誘発する催奇形性には核内受容体の転写抑制が関与することを示唆した。

公開日・更新日

公開日
2007-04-16
更新日
-

研究報告書(紙媒体)

公開日・更新日

公開日
2010-09-08
更新日
-

文献情報

文献番号
200614031B
報告書区分
総合
研究課題名
ハイスループット・ヒト型遺伝毒性試験系の構築
課題番号
H16-創薬-036
研究年度
平成18(2006)年度
研究代表者(所属機関)
能美 健彦(国立医薬品食品衛生研究所 変異遺伝部)
研究分担者(所属機関)
  • 鎌滝哲也(高崎健康福祉大学健康福祉学部)
  • 林宏行(明治製菓株式会社)
  • 渡辺一人(中外製薬)
  • 金谷一司(株式会社JIMRO)
  • 須井 哉(食品薬品安全センター秦野研究所)
  • 小田美光(大阪府公衆衛生研究所)
研究区分
厚生労働科学研究費補助金 厚生科学基盤研究分野 政策創薬総合研究
研究開始年度
平成16(2004)年度
研究終了予定年度
平成18(2006)年度
研究者交替、所属機関変更
-

研究報告書(概要版)

研究目的
本研究班では、医薬品候補化合物の遺伝毒性、胎児毒性を迅速に検出・評価するハイ・スループット試験系を構築するため(1)ヒト遺伝子を発現するin vitro遺伝毒性試験系と(2)in vivo トランスジェニック(TG)ラット、TGマウス遺伝毒性試験系を樹立する。
研究方法
ヒト薬物代謝酵素遺伝子をumu試験用サルモネラ株で発現させた。改良法フラクチュエーションAmes試験(改良法FAT)のテスター株で大腸菌DNA polymerase IV (Pol IV) を発現させた。Pol IV のヒト・ホモローグであるDNA polymerase kappa(hPol k)を用いて5種類の損傷部位の乗り越えDNA合成を行った。gpt delta TGマウスの肺から遺伝毒性試験用のGDL1細胞株を樹立した。S.D.系gpt deltaラットにphenacetinを長期混餌投与し、発がん標的臓器(腎臓)で変異を解析した。S.D.系gpt deltaラットをF344ラットにバッククロスした。ヒトCYP3A7を発現するTGマウス細胞を用いてthalidomideによる催奇形性の機序を検討した。
結果と考察
ヒトNAT1、NAT2、CYP1A2をumu試験菌株で発現させ、S9 mixによる代謝活性化なしに発がん性芳香族アミン類の遺伝毒性を検出した。umu試験のキット化には、赤色の発色試薬(CPRG)が有用であることを明らかにした。改良法FATの結果はAmes試験の結果と良い相関を示し、YG5161を指標菌株にすると相関性がさらに向上した。hPol kはベンツピレン、酸化損傷、アルキル化損傷を乗り越えてDNA合成を続けた。マウスGDL1細胞を用いてcisplatinの遺伝毒性を解析した。Phenacetinはラットの腎臓にG:C to A:T変異を誘発した。発がん試験に汎用されるF344系統でgpt deltaラットを樹立し、より多くの化合物について発がんの標的臓器で遺伝毒性を検出することを可能にした。CYP3A7を発現するマウスにおいてthalidomideの催奇形性が検出され、thalidomideが核内受容体(RAR)に依存した転写を抑制する可能性を示唆した。
結論
医薬品の開発段階初期に、迅速に遺伝毒性を検索するヒト型ハイ・スループット微生物試験菌系を確立し、そのキット化を進めた。発がん性と遺伝毒性の相関を検討するために、TGラットおよびTGマウス細胞遺伝毒性試験系を樹立し、その有用性について検討した。ヒト胎児特異的に発現するCYP3A7を発現するTGマウスを用いた催奇形性検索用の試験系を開発した。

公開日・更新日

公開日
2007-04-16
更新日
-

研究報告書(紙媒体)

公開日・更新日

公開日
2010-09-08
更新日
-

行政効果報告

文献番号
200614031C

成果

専門的・学術的観点からの成果
医薬品開発の初期に遺伝毒性を検索するヒト型ハイ・スループット微生物試験系を確立し、そのキット化を進めた。トランスジェニックラットおよびトランスジェニックマウス細胞遺伝毒性試験系を樹立し、その最適化を行った。ヒトCYP遺伝子を発現するトランスジェニックマウス細胞を用いる催奇形性試験法を開発した。
臨床的観点からの成果
本研究は基礎的な遺伝毒性試験に関する研究で、臨床的な観点からは評価できない。
ガイドライン等の開発
遺伝毒性試験に関するICHの改訂作業が進行しており、従来から用いられてきたin vitro哺乳類細胞試験(染色体異常、遺伝子突然変異)に代わって、二種類のin vivo試験(小核試験ともう一つの試験)が求められる可能性が高まっている。本研究班で開発したトランスジェニックラットを用いることにより、小核と遺伝子突然変異を同一個体を用いて試験することが可能となる。
その他行政的観点からの成果
動物愛護の観点から、できる限り動物を用いる毒性試験を省き、動物を用いる場合には最少限の動物数を用いて試験をすることが求められている。トランスジェニックラットを用いる遺伝毒性試験は、他の毒性試験(発がん試験、28日間試験)と遺伝毒性を結ぶ架け橋であり、トランスジェニックラットを用いて、少数の動物個体からより多くの毒性情報を得ることが可能となる。
その他のインパクト
本研究班で開発したトランスジェニックラット、トランスジェニックマウス遺伝毒性試験は、国際的な評価が高く、WHO IPCS (International Protection for Chemical Safety)の出版するEnvironmental Health Criteria 233, Transgenic Animal Mutagenicity Assaysに取り上げられている。

発表件数

原著論文(和文)
0件
原著論文(英文等)
26件
その他論文(和文)
0件
その他論文(英文等)
7件
学会発表(国内学会)
19件
学会発表(国際学会等)
8件
その他成果(特許の出願)
0件
「出願」「取得」計0件
その他成果(特許の取得)
0件
その他成果(施策への反映)
1件
トランスジェニック遺伝毒性試験の開発とバリデーション
その他成果(普及・啓発活動)
1件
「ハイ・スループット遺伝毒性試験系の構築」について第32回日本トキシコロジー学会学術年会(2005.6)にて講演

特許

主な原著論文20編(論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限る)

論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限ります。

原著論文1
M. Shimizu, P. Gruz, H. Kamiya et al.
Efficient and erroneous incorporation of oxidized DNA precursors by human DNA polymerase eta
Biochemistry , 46 (18) , 5515-5522  (2007)
原著論文2
M. Ikeda, K. Masumura, Y. Sakamoto et al.
Combined genotoxic effects of radiation and a tobacco-specific nitrosamine in the lung of gpt delta transgenic mice
Mutation Research , 626 (1) , 15-25  (2007)
原著論文3
Y. Kuroiwa, T. Umemura, A. Nishikawa et al.
Lack of in vivo mutagenicity and oxidative DNA damage by flumequine in the livers of gpt delta mice
Arch. Toxicol. , 81 (1) , 63-69  (2007)
原著論文4
M. Ikeda, K. Masumura, K. Matsui et al.
Chemopreventive effects of nobiletin against genotoxicity induced by 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK) in the lung of gpt delta transgenic mice
Genes and Environment , 28 (3) , 84-91  (2006)
原著論文5
M. Yamada, T. Nunoshiba, M. Shimizu et al.
Involvement of Y-family DNA polymerases in mutagenesis caused by oxidized nucleotides in Escherichia coli
Journal of Bacteriology , 188 (13) , 4992-4995  (2006)
原著論文6
M. Yamada, K. Matsui and T. Nohmi
Development of a bacterial hyper-sensitive tester strain for specific detection of the genotoxicity of polycyclic aromatic hydrocarbons
Genes and Environment , 28 (1) , 23-30  (2006)
原著論文7
K. Matsui, M. Yamada, M. Imai et al.
Specificity of replicative and SOS-inducible DNA polymerases in frameshift mutagenesis: Mutability of Salmonella typhimurium strains overexpressing SOS-inducible DNA polymerases to 30 chemical mutagens
DNA Repair , 5 (4) , 465-478  (2006)
原著論文8
Y. Asami, M. Murakami, M. Shimizu et al.
Visualization of the interaction between archaeal DNA polymerase and uracil-containing DNA by atomic force microscopy
Genes to Cells , 11 (1) , 3-11  (2006)
原著論文9
A. Takeiri, M. Mishima, K. Tanaka et al.
A newly established GDL1 cell line from gpt delta mice well reflects the in vivo mutation spectra induced by mitomycin C
Mutation Research , 609 (1) , 102-115  (2006)
原著論文10
T. Umemura, K. Kanki, Y. Kuroiwa et al.
In vivo mutagenicity and initiation following oxidative DNA lesion in the kidneys of rats given potassium bromate
Cancer Science , 97 (9) , 829-835  (2006)
原著論文11
A. Nishikawa, K. Sai, K. Okazaki et al.
MX, a by-product of water chlorination, lacks in vivo genotoxicity in gpt delta mice but inhibits gap junctional intercellular communication in rat WB cells
Environmental and Molecular Mutagenesis , 47 (1) , 48-55  (2006)
原著論文12
L. Jiang, Y. Zhong, S. Akatsuka et al.
Deletion and single nucleotide substitution at G:C in the kidney of gpt delta transgenic mice after ferric nitrilotriacetate treatment
Cancer Science , 97 (11) , 1159-1167  (2006)
原著論文13
M. Miyazaki, H. Yamazaki, H. Takeuchi et al.
Mechanisms of chemopreventive effects of 8-methoxypsoralen against 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone-induced mouse lung adenomas
Carcinogenesis , 26 (11) , 1947-1955  (2005)
原著論文14
Y. Totsuka, R. Nishigaki, S. Enomoto et al.
Structures and biological properties of DNA adducts derived from N-nitroso bile acid conjugates
Chemical Research in Toxicology , 18 (10) , 1553-1562  (2005)
原著論文15
S.-R. Kim, K. Kokubo, K. Matsui et al.
Light-dependent mutagenesis by benzo[a]pyrene is mediated via oxidative DNA damage
Environmental and Molecular Mutagenesis , 46 (3) , 141-149  (2005)
原著論文16
K. Kokubo, M. Yamada, Y. Kanke et al.
Roles of replicative and specialized DNA polymerases in frameshift mutagenesis: mutability of Salmonella typhimurium strains lacking one or all of SOS-inducible DNA polymerases to 26 chemicals
DNA Repair , 4 (10) , 1160-1171  (2005)
原著論文17
A. Shibata, N. Kamada, K. Masumura et al.
Parp-1 deficiency causes an increase of deletion mutations and insertions/rearrangements in vivo after treatment with an alkylating agent
Oncogene , 24 (8) , 1328-1337  (2005)
原著論文18
K. Kanki, A. Nishikawa, K. Masumura et al.
in vivo mutational analysis of liver DNA in gpt delta transgenic rats treated with the hepatocarcinogens N-nitrosopyrrolidine, 2-amino-3-methylimidazo[4,5-f]quinoline, and di(2-ethylhexyl)phthalate
Molecular Carcinogenesis , 42 (1) , 9-17  (2005)
原著論文19
S.-R. Kim, K. Matsui, M. Yamada et al.
Suppression of chemically-induced and spontaneously occurring oxidative mutagenesis by three alleles of human OGG1 gene encoding 8-hydroxyguanine DNA glycosylase
Mutation Research , 554 (1) , 365-374  (2004)
原著論文20
A. Shibata, M. Masutani, N. Kamada et al.
An efficient method for mapping and characterizing structures of deletion mutations in gpt delta mice using Southern blot analysis with oligo DNA probes
Environmental and Molecular Mutagenesis , 43 (3) , 204-207  (2004)

公開日・更新日

公開日
2015-05-26
更新日
-