ウイルスRNA結合ペプチドを用いたC型肝炎治療薬の開発

文献情報

• 文献番号: 200614026A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: ウイルスRNA結合ペプチドを用いたC型肝炎治療薬の開発
• 課題番号: H16-創薬-031
• 研究年度: 平成18(2006)年度
• 研究代表者(所属機関): 鈴木 哲朗(国立感染症研究所)

研究分担者(所属機関)

• 原田　和雄(進化創薬株式会社)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 厚生科学基盤研究分野 政策創薬総合研究
• 研究開始年度: 平成16(2004)年度
• 研究終了予定年度: 平成18(2006)年度
• 研究費: 8,000,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

既存の治療薬とは異なる作用機序を有し、より有効かつ副作用の少ない抗HCV薬が開発されることにより、慢性C型肝炎を制圧し、肝硬変、肝細胞癌の発生を防ぐことが可能となる。本研究では、HCVの複製に必須なウイルスRNA領域に対する、選択性の高い結合ペプチドを創製し、C型肝炎治療薬としての開発を目指す。

研究方法

RNA結合ペプチドのHCV RNA複製阻害活性は、HCVサブジェノミックレプリコン細胞（遺伝子型1b）にペプチドを種々の濃度で添加、または発現プラスミドを導入し２または４日間培養した後、細胞内HCV RNAをリアルタイムRT-PCR法で測定することによって評価した。

結果と考察

(1) HCV-RNA結合ペプチドの抗HCV作用：3’UTR内のstem-loop (SL) 2に対する結合をアルギニンリッチペプチドコンビナトリアルライブラリーから探索し、SL2選択的に結合活性を示す３配列を同定した。これらは配列中の特定の位置に共通したアミノ酸残基を有していることから、標的RNAに特異的に結合する構造的特徴を有することが期待された。これらのペプチドを発現するプラスミドを作製し、レプリコン細胞へ導入したところ、１種類のペプチド#5でHCV RNA複製阻害効果が認められた。この#5ペプチドと同様のアミノ酸組成を持ち配列を入れ替えた変異ペプチドではこのような阻害効果は認められなかった。(2) SL2結合ペプチドの再スクリーニング： SL2結合ペプチド・ドープ・ライブラリーから、よりも高いRNA結合活性を示すペプチドの同定を試み、SL2結合ペプチド#5に比べ有意に結合能の高い複数クローンを同定した。(3) HCV翻訳調節に関与するシスエレメントの解析：HCV翻訳調節に重要な新規RNAエレメントとして、コア遺伝子のA rich領域を同定した。RNA結合ペプチド探索の新たな標的となりうる。

結論

HCV 3’UTR SL2領域と選択的に結合するペプチド３種類が同定され、そのうちの１種類に細胞内でHCV RNA複製を抑制する可能性が示された。ライブラリー探索から、さらに高いRNA結合活性を示す「進化型」SL2結合ペプチドを同定した。

公開日・更新日

• 公開日: 2007-04-12
• 更新日: -

文献情報

• 文献番号: 200614026B
• 報告書区分: 総合
• 研究課題名: ウイルスRNA結合ペプチドを用いたC型肝炎治療薬の開発
• 課題番号: H16-創薬-031
• 研究年度: 平成18(2006)年度
• 研究代表者(所属機関): 鈴木 哲朗(国立感染症研究所)

研究分担者(所属機関)

• 原田　和雄(進化創薬株式会社)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 厚生科学基盤研究分野 政策創薬総合研究
• 研究開始年度: 平成16(2004)年度
• 研究終了予定年度: 平成18(2006)年度
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

既存の治療薬とは異なる作用機序を有し、より有効かつ副作用の少ない抗HCV薬が開発されることにより、慢性C型肝炎を制圧し、肝硬変、肝細胞癌の発生を防ぐことが可能となる。本研究では、HCVの複製に必須なウイルスRNA領域に対する、選択性の高い結合ペプチドを創製し、C型肝炎治療薬としての開発を目指す。

研究方法

独自に開発したRNA 結合ペプチド検出系KANシステムを利用してHCV RNA結合ペプチドを探索した。IRES活性測定法、HCV RNA複製細胞系等によりペプチドの抗HCV活性を評価した。

結果と考察

(1) HCV RNA結合ペプチドのスクリーニング：HCV翻訳に重要な 5’UTR IRES領域のdomain IIIa,c、IIIb、IIIdに結合するペプチドをアルギニンリッチペプチドコンビナトリアルライブラリーから探索しIIIa,c結合ペプチド３配列及びIIId結合ペプチド２配列を同定した。RNA複製に重要な3’UTR SL2領域に特異的に結合する３配列を同定した。(2) HCV-RNA結合ペプチドの抗HCV作用：IRES結合ペプチドのうち１種類がHCV IRES活性を有意に阻害し、cap依存的翻訳には影響を及ぼさないことを見出した。SL2結合ペプチドのうち１種類(#5)がレプリコン細胞においてHCV RNA複製阻害効果を示した。このペプチドと同様のアミノ酸組成を持ち配列を入れ替えた変異ペプチドでは阻害効果は認められなかった。(3) SL2結合ペプチドの再スクリーニング： SL2結合ペプチド・ドープ・ライブラリーから、より高いRNA結合活性を示すペプチドの同定を試み、SL2結合ペプチド(#5)に比べ有意に結合能の高い複数クローンを同定した。(4) HCV翻訳調節に関与するシスエレメントの解析：HCV翻訳調節に重要な新規RNAエレメントとして、コア遺伝子のA rich領域を同定した。RNA結合ペプチド探索の新たな標的となりうる。

結論

独自に開発したKANシステムによりHCV RNA結合ペプチドを同定した。IRES結合ペプチド１種類がHCV IRES活性を阻害し、3’UTR SL2結合ペプチド１種類がHCV RNA複製を抑制することを示した。さらにRNA結合能を高めた進化型SL2結合ペプチドを得ており、抗HCV薬候補として期待される。

公開日・更新日

• 公開日: 2007-04-12
• 更新日: -

行政効果報告

• 文献番号: 200614026C

成果

• 専門的・学術的観点からの成果: 本研究グループが独自に開発したRNA結合ペプチド探索法を使ってC型肝炎ウイルス（HCV）結合ペプチドを８種類同定した（特許出願）。このうち、5’末端RNA結合ペプチド１種類がウイルス翻訳を、3’末端結合ペプチド１種類がゲノム複製をそれぞれ抑制することを見出した。抗HCV作用を有するRNA結合ペプチドが初めて明らかとなった。治療薬開発への応用のみならずHCVの複製機構を解析するためのツールとしても極めて有用性が高い。
• 臨床的観点からの成果: インターフェロンを基軸とした現行のC型肝炎治療法の有効率は40-50%程度であり、多くの肝炎患者は肝癌発症のリスクを避けられない。現在臨床試験段階にあるウイルス酵素阻害剤は、薬剤耐性ウイルスの出現が問題となっている。本研究で見出されたRNA結合ペプチドは、これらと異なる作用機序を持つ抗HCV物質である。ペプチド創薬は１）化学合成技術が確立し医薬品としての実績がある、２）細胞内への透過性に問題がない、３）RNA創薬に比べて分子量が大きくない、などの利点があり研究成果の臨床応用が大いに期待される。
• ガイドライン等の開発: ガイドライン等の開発は行っていない。
• その他行政的観点からの成果: C型肝炎は我が国の国民病とも言われ、現在HCV感染者数は、我が国に約200万人、世界中には1.7億人にのぼる。既存の治療薬とは異なる作用機序を有し、より有効かつ副作用の少ない抗HCV薬が開発されることにより、慢性C型肝炎を制圧し、肝硬変、肝細胞癌の発生を防ぐことが可能となる。高齢化社会をむかえ、より質の高い生活が求められる現在、その社会的要請は極めて高い。抗HCVペプチドが新たな治療薬として実用化されれば慢性肝疾患の発症率を引き下げ、医療費の低減に貢献できるものと思われる。
• その他のインパクト: 関連学会（ウイルス学会、分子生物学会）、原著論文、及び著書にて成果発表を行った。

発表件数

• 原著論文（和文）: 0件
• 原著論文（英文等）: 15件
• その他論文(和文): 4件
• その他論文(英文等): 2件
• 学会発表(国内学会): 5件
• 学会発表(国際学会等): 0件
• その他成果(特許の出願): 0件 ; 「出願」「取得」計1件
• その他成果(特許の取得): 0件 ; 出願番号：2005-300350
• その他成果(施策への反映): 0件
• その他成果(普及・啓発活動): 0件

主な原著論文20編（論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限る）

• 原著論文1: Shirakura M, Murakami K, Suzuki T, et al.; E6AP ubiquitin ligase mediates ubiquitylation and degradation of hepatitis C virus core protein; J. Virol. , 81 , 1174-1185 (2007)
• 原著論文2: Moriishi K., Suzuki T.,Matsuura Y., et al. ; Critical role of PA28gamma in hepatitis C virus-associated steatogenesis and hepatocarcinogenesis. ; Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 104 , 1661-1666 (2007)
• 原著論文3: 5. Miyamoto H, Moriishi K, Moriya K, Murata S, Tanaka K, Miyamoto H, Suzuki T, Matsuura Y.et al. ; Involvement of PA28gamma-dependent pathway in insulin resistance induced by hepatitis C virus core protein. ; J. Virol. , 81 , 1727-1735 (2007)
• 原著論文4: Nakai K, Suzuki T, Matsuura Y.et al. ; Oligomerization of hepatitis C virus core protein is crucial for interaction with cytoplasmic domain of E1 envelope protein; J. Virol. , 80 , 11265-11273 (2006)
• 原著論文5: Okamoto T, Suzuki T, Matsuura Y.et al. ; Hepatitis C virus RNA replication is regulated by FKBP8 and Hsp90; EMBO J. , 25 , 5015-5025 (2006)
• 原著論文6: Murakami K, Ishii K, Suzuki T, et al.; Production of infectious hepatitis C virus particles in three-dimensional cultures of the cell line carrying the genome-length dicistronic viral RNA of genotype 1b; Virology , 351 , 381-392 (2006)
• 原著論文7: Shimoike T, Koyama C, Suzuki T, et al. ; Down-regulation of the internal ribosome entry site (IRES)-mediated translation of the hepatitis C virus: critical role of binding of the stem-loop IIId domain of IRES and the viral core protein. ; Viroogy , 345 , 434-445 (2006)
• 原著論文8: Suzuki, R., Sakamoto,S., Suzuki T, et al.; Molecular determinants for subcellular localization of hepatitis C virus core protein. ; J. Virol. , 79 , 1271-1281 (2005)
• 原著論文9: Suzuki,T., Omata,K., Satoh,T., et al.; Quantitative detection of hepatitis C virus (HCV) RNA in saliva and gingival crevicular fluid of HCV-infected patients. ; J. Clin. Microbiol. , 43 , 4413-4417 (2005)
• 原著論文10: Hamamoto, I., Suzuki T, Matsuura Y.et al. ; Human VAP-B is involved in hepatitis C virus replication through interaction with NS5A and NS5B. ; J. Virol. , 79 , 13473-13482 (2005)
• 原著論文11: Suzuki T., Suzuki R., Li J., et al.; Identification of basal promoter and enhancer elements in an untranslated region of the TT virus genome. ; J. Virol. , 78 , 10820-10824 (2004)
• 原著論文12: X. Li, S. Horiya, and K. Harada ; An efficient thermally induced RNA conformational switch as a framework for the functionalization of RNA nanostructures. ; J. Am. Chem. Soc. , 128 , 4035-4040 (2006)
• 原著論文13: Yano, M. Kunimoto, T, K. Harada et al.; Identification of antisense stem-loops that inhibit RNA-protein interactions using a bacterial reporter system; Nucleic Acids Symp. Ser. , 50 , 77-78 (2006)
• 原著論文14: Iwazaki, T., Li, X, and Harada, K. ; Evolvability of the mode of peptide-binding by an RNA.; RNA , 11 , 1364-1373 (2005)
• 原著論文15: Ohmori, R., Hakozaki, S., and Harada, K. ; Regulation of the structure of RNA assemblies through RNA tertiary interactions.; Nucleic Acids Symp. Ser. , 49 , 193-194 (2005)

公開日・更新日

• 公開日: 2015-05-26
• 更新日: -