バイオフォトニクスを利用した細胞組織障害を視る、測る、解析する技術の開発

文献情報

• 文献番号: 200614009A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: バイオフォトニクスを利用した細胞組織障害を視る、測る、解析する技術の開発
• 課題番号: H16-創薬-010
• 研究年度: 平成18(2006)年度
• 研究代表者(所属機関): 川西 徹(国立医薬品食品衛生研究所)

研究分担者(所属機関)

• 藤村　久子(田辺製薬株式会社)
• 小林　薫(三菱ウェルファーマ株式会社)
• 古田　寿昭(東邦大学理学部)
• 大幡　久之(昭和大学薬学部)
• 今泉　祐治(名古屋市立大学薬学部)
• 重信　弘毅(東邦大学薬学部)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 厚生科学基盤研究分野 政策創薬総合研究
• 研究開始年度: 平成16(2004)年度
• 研究終了予定年度: 平成18(2006)年度
• 研究費: 11,500,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

疾病治療用医薬品の創薬において最も重要な基盤技術の一つに，疾患に伴って生じる細胞組織障害を解析する技術があげられる．本研究は，細胞機能に係る生体内パラメータに対する感受性蛍光プローブを開発・利用することにより，細胞組織障害を簡便かつ定量的に解析する方法を確立し，創薬シーズ探索のためのハイスループットスクリーニング，医薬品候補化合物のセレクション，タンパク質性医薬品の品質（生物活性）評価等へ応用することを目指して実施した．

研究方法

研究は，（１）細胞組織障害を解析するためのバイオフォトニクスプローブの開発（２）バイオフォトニクスプローブ使用に最適化した解析機器の開発（３）開発されたプローブおよび解析機器の生体への応用技術の開発，の３つの視点から行った．

結果と考察

バイオフォトニクスプローブの開発: ダブルFRET細胞組織障害解析法を用いて小胞体ストレスによる細胞障害の解析を行い，単一細胞における2種の反応の活性化状況の解析に成功した．また，その他の細胞障害解析用プローブの開発，検討を行なった．さらに，ケージドペプチド核酸やケージドジアシルグリセロール等により遺伝子の機能発現の光制御，もしくはタンパク質の機能制御に成功した．
解析系の開発: 内皮依存的な弛緩反応における弛緩応答，カルシウム応答およびNO産生の評価系を確立した．また，ペースメーカー細胞の再構築によりK+チャネル関連細胞機能障害解析細胞系を開発した．さらに心筋由来H9c2細胞系と蛍光プローブにより心筋ミトコンドリア機能を検出する系を確立した．
応用技術の開発: 遺伝子発現および脂肪酸特異的蛍光プローブの集積を指標として、肝細胞における薬物の脂肪蓄積誘発性のプロファイリング/スクリーニング系を構築した．また，組換えタンパク質生産細胞のミトコンドリア膜電位を評価することで，細胞のタンパク質産生能力を比較・推定できる可能性を示した．

結論

バイオフォトニクスプローブを開発・利用することにより，各種細胞組織障害を簡便かつ定量的に解析する方法の開発に成功した．開発した技術はいずれも創薬支援技術として非常に有用である．

公開日・更新日

• 公開日: 2007-04-16
• 更新日: -

文献情報

• 文献番号: 200614009B
• 報告書区分: 総合
• 研究課題名: バイオフォトニクスを利用した細胞組織障害を視る、測る、解析する技術の開発
• 課題番号: H16-創薬-010
• 研究年度: 平成18(2006)年度
• 研究代表者(所属機関): 川西 徹(国立医薬品食品衛生研究所)

研究分担者(所属機関)

• 藤村　久子(田辺製薬株式会社)
• 小林　薫(三菱ウェルファーマ株式会社)
• 古田　寿昭(東邦大学理学部)
• 大幡　久之(昭和大学薬学部)
• 今泉　祐治(名古屋市立大学薬学部)
• 重信　弘毅(東邦大学薬学部)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 厚生科学基盤研究分野 政策創薬総合研究
• 研究開始年度: 平成16(2004)年度
• 研究終了予定年度: 平成18(2006)年度
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

疾病治療用医薬品の創薬において最も重要な基盤技術の一つとして，疾患に伴って生じる細胞組織障害を解析する技術があげられる．本研究は，細胞機能に係る生体内パラメータに対する感受性蛍光プローブを開発・利用することにより，細胞組織障害を簡便かつ定量的に解析する方法を確立し，創薬シーズ探索のためのハイスループットスクリーニング，医薬品候補化合物のセレクション，タンパク質性医薬品の品質（生物活性）評価等への応用を目指した．

研究方法

研究は，細胞組織障害を解析するためのバイオフォトニクスプローブの開発，バイオフォトニクスプローブ使用に最適化した解析機器の開発，開発されたプローブおよび解析機器の生体への応用技術の開発，の３つの視点から行った．

結果と考察

バイオフォトニクスプローブの開発: 各種のカスパーゼ活性化検出プローブを設計，開発し，さらにダブルFRET法により，他の手法では確認が困難な単一細胞における複数の活性化反応の解析に成功した．開発した細胞障害解析用プローブを併用することにより，細胞組織障害に関わる複数の要因の空間的・時間的解析が可能となる．さらに，ケージド化合物を作製して細胞応答を高い時空間分解能で制御する方法について検討し，遺伝子の転写やタンパク質機能の光制御に成功した．
解析系の開発: 微小血管組織の反応性を構造的・機能的に解析するのに有用であり，かつ血管障害性物質の評価および障害機序の検討に応用可能な，多光子励起顕微鏡を利用した細胞内カルシウムイオン動態と血管機能および細胞障害性の解析システムを構築した．また，K+チャネル作動性薬物のスクリーニングおよびその細胞機能障害性の検索に利用可能なペースメーカー細胞の再構築系を確立した．さらに心筋由来H9c2細胞系と蛍光プローブを用いて心筋ミトコンドリア機能を検出する系を確立した．
応用技術の開発: 肝臓における脂肪蓄積誘発性のプロファイリング/スクリーニング系を構築した．また，組換えタンパク質生産用のアポトーシス耐性宿主細胞を取得すると共に，ミトコンドリア膜電位を評価することで，細胞のタンパク質産生能力を比較・推定できる可能性を示した．

結論

バイオフォトニクスプローブを開発・利用することにより，各種細胞組織障害を簡便かつ定量的に解析する方法の開発に成功した．開発した技術はいずれも創薬支援技術として非常に有用である．

公開日・更新日

• 公開日: 2007-04-16
• 更新日: -

行政効果報告

• 文献番号: 200614009C

成果

• 専門的・学術的観点からの成果: 細胞機能解析用のバイオフォトニクスプローブを設計・作製・利用し、創薬における様々な局面に応用可能な、細胞組織障害の簡便かつ定量的解析法の開発研究を行い、各種カスパーゼカスケード解析用プローブ、細胞内伝達反応を局所的に制御可能なケージド化合物、K+チャネルが関連する細胞障害解析用細胞モデル、多光子励起顕微鏡によるin situ 組織障害解析系、および薬物の脂肪蓄積誘発性スクリーニング系の開発に成功し、また組換えタンパク質生産細胞のタンパク質生産能モニタリングも試みた。
• 臨床的観点からの成果: 本研究で開発したバイオフォトニクスプローブを用いた細胞障害解析法は、医薬品候補化合物のハイスループット・スクリーニング、医薬品候補化合物の作用メカニズムの解析、医薬品候補化合物の有害作用の解析等に利用され、画期的医薬品の創製の基盤技術となる。さらにこれらの技術は、開発された医薬品の製造管理、品質管理にも応用が可能である。このように医薬品開発の促進、および医薬品の品質の確保・向上を通じて、疾病治療に貢献する。
• ガイドライン等の開発: 創薬は国民の健康維持に貢献するとともに、医薬品産業は知識集約産業であることから、21世紀の我が国の産業基盤として注目を浴びている。しかし一方では、医薬品開発のコストの増大、承認医薬品数の減少が問題としてクローズアップされている。この問題点を克服するため、現在疾病マーカー、毒性マーカー等の評価指標の確立および簡便な評価法開発が世界的な課題となっている。本研究は、この課題の解決の原動力となる研究であり、今後開発された解析法の標準化を経て、医薬品承認申請ガイドライン等に取り入れられてゆくと考えられる。
• その他行政的観点からの成果: バイオフォトニクスプローブを用いた細胞障害解析法は、創薬基盤技術として重要であるばかりでなく、疾病の診断への応用、疾病の治療への応用など、医療全般への応用の可能性を秘めた波及効果の大きい技術である。したがって、国民の健康維持、安心・安全をはかるという意味からも、行政的にも継続的に推進すべき課題である。
• その他のインパクト: バイオフォトニクスプローブによる生体機能測定法を支える基盤技術は、ミクロ有機合成技術、ナノテクノrロジー、バイオテクノロジー、分子細胞生物学、光学技術、エレクトロニクスであるが、これらはいずれもが我が国が得意とする分野であり、かつ21世紀においても我が国において成長が期待される産業である。したがって本研究の成功は、これら技術分野に開発目標を与え、その活性化を促し、我が国の産業技術の国際的競争力の強化に結びつくものである。

発表件数

• 原著論文（和文）: 0件
• 原著論文（英文等）: 51件
• その他論文(和文): 14件
• その他論文(英文等): 1件
• 学会発表(国内学会): 80件
• 学会発表(国際学会等): 6件
• その他成果(特許の出願): 0件 ; 「出願」「取得」計0件
• その他成果(特許の取得): 0件
• その他成果(施策への反映): 0件
• その他成果(普及・啓発活動): 0件

主な原著論文20編（論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限る）

• 原著論文1: H. Kawai, T. Suzuki, T. Kobayashi, H. et al.; Simultaneous imaging of initiator / effector caspase activity and mitochondrial membrane potential during cell death in living HeLa cells.; Biochim. Biophys. Acta , 1693 , 101-110 (2004)
• 原著論文2: H. Tanaka, C. Komikado, H. Shimada et al.; The R(-)-Enantiomer of Efonidipine Blocks T-type but Not L-type Calcium Current in Guinea-Pig Ventricular Myocardium.; J. Pharmacol. Sci. , 96 , 499-501 (2004)
• 原著論文3: T. Nishigaki, C. D. Wood, Y. Tatsu et al.; A sea urchin jelly peptide induces a cGMP-mediated decrease in sperm intracellular Ca2+ before its increase.; Dev. Biol. , 272 , 376-388 (2004)
• 原著論文4: T. Furuta, H. Takeuchi, M. Isozaki et al.; Bhc-cNMPs as either water-soluble or membrane-permeant photo-releasable cyclic nucleotides for both one and two-photon excitation. ; ChemBioChem , 5 , 1119-1128 (2004)
• 原著論文5: Masahiro Aoyama, Aki Yamada, Jing Wang et al.; Requirement of ryanodine receptor for pacemaker Ca2+ activity in ICC and HEK293 cells transfected with RyR3.; J. Cell Sci. , 171 , 2813-2825 (2004)
• 原著論文6: H. Kawai, T. Suzuki, T. Kobayashi, H. et al.; Simultaneous real-time detection of initiator- and effector-caspase activation by double FRET analysis.; J. Pharmacol.Sci. , 97 , 361-368 (2005)
• 原著論文7: Tanaka H., Namekata I., Takeda K. et al.; Unique excitation -contraction characteristics of mouse myocardium as revealed by SEA0400, a specific inhibitor of Na+-Ca2+ exchanger.; Naunyn-Schmied. Arch. Pharmacol. , 371 , 526-534 (2005)
• 原著論文8: Tanaka H., Shigenobu K; Pathophysiological significance of T-type calcium channels: T-type calcium channels and drug development.; J. Pharmacol. Sci. , 99 , 214-220 (2005)
• 原著論文9: Bai C., Namekata I., Kurokawa J. et al.; Role of nitric oxide in Ca2+ sensitivity of the slowly activating delayed rectifier K+ current in cardiac myocytes. ; Circ. Res. , 96 , 64-72 (2005)
• 原著論文10: C. D. Wood, T. Nishigaki, T. Furuta et al.; Real-time analysis of the role of Ca(2+) in flagellar movement and motility in single sea urchin sperm. ; J. Cell. Biol. , 169 , 725-731 (2005)
• 原著論文11: T. Suzuki, T. Nishimaki-Mogami, H. Kawai et al.; Screening of novel nuclear receptor agonists by a convenient reporter gene assay system using GFP derivatives.; Phytomedicine , 13 , 401-411 (2006)
• 原著論文12: Namekata I., Kawanishi T., Iida-Tanaka N. et al.; Quantitative fluorescence measurement of cardiac Na+/Ca2+ exchanger inhibition by kinetic analysis in stably transfected HEK293 cells.; J. Pharmacol. Sci. , 101 , 356-360 (2006)
• 原著論文13: Namekata I., Shimada H., Kawanishi T. et al.; Reduction by SEA0400 of myocardial ischemia-induced cytoplasmic and mitochondrial Ca2+ overload.; Eur. J. Pharmacol. , 533 , 108-115 (2006)
• 原著論文14: A. Specht, J. S. Thomann, K. Alarcon, W. et al.; New Photoremovable Protecting Groups for Carboxylic Acids with High Photolytic Efficiencies at Near-UV Irradiation. Application to the Photocontrolled Release of L-Glutamate. ; ChemBioChem , 7 , 1690-1695 (2006)
• 原著論文15: Hashimoto, T., H. Ohata and K. Honda. ; Lysophosphatidic acid induces plasma exudation and histamine release in mice via LPA.; J. Pharmacol. Sci. , 100 , 82-87 (2006)
• 原著論文16: Yamazaki D, Aoyama M, Ohya S et al.; Novel functions of small conductance Ca2+-activated K+ channel in enhanced cell proliferation by ATP in brain endothelial cells.; J. Biol. Chem. , 281 , 38430-38439 (2006)
• 原著論文17: H. Kawai, T. Suzuki, T Kobayashi et al.; Caspase cascade proceeds rapidly after cytochrome c release from mitochondria in TNF-α-induced cell death.; J. Pharmacol. Sci. , 103 , 159-167 (2007)
• 原著論文18: Tanaka H., Shimada H., Namekata I. et al.; Involvement of the Na+/Ca2+ exchanger in ouabain-induced inotropy and arrhythmogenesis in guinea-pig myocardium as revealed by SEA0400.; J. Pharmacol. Sci. , 103 , 241-246 (2007)
• 原著論文19: Morimoto T, Sakamoto K, Sade H et al.; Voltage-sensitive oxonol dyes are novel large-conductance Ca2+-activated K+ channel activators selective for β1 and β4 but not for β2 subunits.; Mol. Pharmacol. , 71 , 1075-1088 (2007)
• 原著論文20: Fujimura H. Dekura E. Kurabe M. et al.; Cell-based fluorescence assay for evaluation of new drugs potential for phospholipidosis in an early stage of drug development.; Exp. Toxicol. Pathol. (2007)

公開日・更新日

• 公開日: 2015-05-26
• 更新日: 2015-06-16