ウイルス性食中毒原因の遺伝子検査標準法確立と全国行政対応整備に関する研究

文献情報

• 文献番号: 199700130A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: ウイルス性食中毒原因の遺伝子検査標準法確立と全国行政対応整備に関する研究
• 課題番号: -
• 研究年度: 平成9(1997)年度
• 研究代表者(所属機関): 川本 尋義(岐阜県保健環境研究所)

研究分担者(所属機関)

• 沢田春美(北海道立衛生研究所)
• 斎藤博之(秋田県衛生科学研究所)
• 三上稔之(青森県環境保健センター)
• 秋山和夫(宮城県保健環境センター)
• 篠川旦(新潟県衛生公害研究所)
• 関根大正(東京都立衛生研究所)
• 野口有三(横浜市衛生研究所)
• 杉枝正明(静岡県衛生環境センター)
• 柴田伸一郎(名古屋市衛生研究所)
• 山下照夫(愛知県衛生研究所)
• 松本和男(福井県衛生研究所)
• 春木孝祐(大阪市立環境科学研究所)
• 山崎謙治(大阪府立公衆衛生研究所)
• 池田義文(広島市衛生研究所)
• 大瀬戸光明(愛媛県立衛生研究所)
• 大津隆一(福岡県保健環境研究所)
• 大野惇(沖縄県衛生環境研究所)
• 宇田川悦子(国立感染症研究所)

• 研究区分: 厚生科学研究費補助金 行政政策研究分野 厚生科学特別研究事業
• 研究開始年度: 平成9(1997)年度
• 研究終了予定年度: 平成11(1999)年度
• 研究費: 10,000,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

ウイルス性食中毒遺伝子診断法(小型球形ウイルスSRSVのRTーPCR法)の開発とその確立、国内ウイルス性食中毒の分子疫学解析による実態解明、食品衛生行政対応施策への提言とその整備についての研究を全国のウイルス研究者と連携し行う。

研究方法

本研究では全国を地方ブロック(北海道、東北、関東甲信越、中部、中国、四国、九州、沖縄)に分け、各地で発生のウイルス性食中毒患者や食品からSRSVについてウイルス遺伝子検出を行いRTーPCR法改良と分子疫学を実施。
1)ウイルス遺伝子検査としてまだ煩雑な逆転写遺伝子連鎖増幅(RT-PCR)法の簡素化と感度向上を図る。2)SRSV・RT-PCRは可能な限り標準化しGLP化に向けた検討を図る。3)研究班成果は所管行政部局(厚生省生活衛生局食品保健課・乳肉衛生課、地方自治体衛生部主管課等)に情報還元する。4)地方ブロック研究班分担者においては地方特性と疫学的データ解析を行い研究班会議にて報告する。
5)研究班全体として各地のウイルス性食中毒状況を総括し、国内SRSVの分布、動向、特性を遺伝学的に評価する。6)研究成果は班会議にて総括する。
7)研究成果は学会学術雑誌等に公表し、厚生科学研究事業総括報告書にまとめ報告する。

結果と考察

ウイルス性食中毒小型球形ウイルス(SRSV)遺伝子検査逆転写遺伝子連鎖増幅(RT-PCR)法の改良点:研究班では平成9年度開催の班成果解析評価検討会議平成10年3月14～15日で分担研究者、協力研究者からRT-PCR法について以下の具体的改良策や意見が得られた。(1)ウイルス遺伝子抽出に市販キットを積極的に導入することで効率的かつ有効かつ有害廃棄物・危険物対策が可能。(2)反応系は1チューブ1ステップRTーPCRのシステムが可能で1st RT-PCRのみの遺伝子診断が望ましい。従来法(通達)では逆転写(RT)と遺伝子連鎖増幅(PCR)は別個で反応し、更にネステッド(第2次)PCR実施により増感するなど煩雑かつ核酸汚染を助長する方式が採入れていた。(3)米国のノーウォーク・ウイルスを代表とするSRSV遺伝子型群G1とスノーマウンテン、メキシコ、トロント・ウイルスを代表とするG2型との遺伝子共用塩基配列をもとに設計した2本の遺伝子診断組プライマー(合計4本の検出用合成遺伝子)をSRSV検出系に用いた結果、日本国内では遺伝子型群G2が多く検出され出現確率が高い傾向がみられた。しかしそこで、日本SRSV株の一部を塩基配列解析した結果、使用組プライマーでも増幅されないSRSV株があり、日本独自の遺伝子クローニングとその解析の必要が生まれた。それら代表株であった秋田県由利株の塩基配列をもとにプライマー設計し改良した結果、食中毒患者糞便は勿論のこと食品の生かきからも高率に検出され検出感度が向上した。(4)抽出ウイルス遺伝子RNAからの遺伝子増幅に先立ち試料を予めDNAase処理することで他種遺伝子DNA汚染を阻止し明瞭な検査結果を得ることができたので改良法には追加記述する。なお、これら処理により最初のRTーPCRのみで検出率向上が認められた。

結論

SRSVのRT-PCR原法は米国のJiang ら(J.Clin.Mic-robiol.30: 2529-2534,1992) の報告による。われわれは前年までの「ウイルス性胃腸炎研究班」としてその原法をもとに有用性や限界を確認し暫定改良法をまとめ厚生省からの平成9年1月31日付通達の検査指針に盛り込んだ。実際の食中毒事例に対するSRSV検査では、検体からのウイルス抽出・濃縮・精製、さらには安定的なRNA抽出(CTAB法などの必要処置)など、煩雑な上に分子生物学的各種手法が必要で経験と熟練を要した。将来、保健所や検疫所、または民間食品検査機関で検査を実施することを想定すると一般的ウイルス検査法とするにはとても非効率で困難を伴う方法であった。また、日本国内のウイルス性食中毒でSRSV遺伝子を全て検出可能とするには次のような問題も明らかとなってきた。即ち、SRSVには少なくとも2種以上の遺伝子型群(ジェノグループと呼ぶ:G1またはG2)が存在する。昨年7月米国ジョージア州アトランタ市CDC主催の日米医学協力研究・ウイルス性疾患専門家会議、胃腸炎ウイルス部会において共同研究成果や研究現状報告等の相互意見交換の場でも、通常検出用組プライマー(平成9年1月31日厚生省通達に記載)は食中毒事件原因SRSVの一部の日本株に塩基配列部位に置換が見つかり、プライマーとのミスマッチによるPCR増幅ができないなどの問題が報告された。従って、われわれ日本側研究者には新規診断用プライマー設計など早急に改良すべき具体的問題や課題が浮上した。RT-PCR法を行政として用いるには、SRSV粒子内から無損傷のRNAを効率的に抽出回収し、相補的転写DNAを高率に作成(cDNA)し、時として他種の生物由来核酸(DNA)汚染をも効果的に防止し、手技等操作性においてもより簡便であることが重要な改正ポイントとなる。そこで、核酸抽出にも積極的に効率の良い市販キットを導入することとし、RTーPCR法術式も簡素化(RT逆転写とPCR遺伝子連鎖増幅も同一微量試験管反応系として行うなど)を図らねばならないと考え、方法論の改正が本研究班の第一の研究目的であり、第二の目標は改良法普及による国内SRSVとウイルス性食中毒の分子疫学である。これら方法論をもとに行政課題の推進と全国対応整備に資する。

公開日・更新日

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