ＨＩＶ－１制御遺伝子を標的とした新規抗ウイルス剤開発

文献情報

文献番号
200500996A
報告書区分
総括
研究課題名
ＨＩＶ－１制御遺伝子を標的とした新規抗ウイルス剤開発
課題番号
H16-創薬-009
研究年度
平成17(2005)年度
研究代表者(所属機関)
酒井　博幸(京都大学ウイルス研究所)
研究分担者(所属機関)
  • 土方　誠(京都大学ウイルス研究所)
研究区分
厚生労働科学研究費補助金 健康安全確保総合研究分野 創薬等ヒューマンサイエンス総合研究
研究開始年度
平成16(2004)年度
研究終了予定年度
平成17(2005)年度
研究費
5,000,000円
研究者交替、所属機関変更
-

研究報告書（概要版）

研究目的
この研究課題では新規抗ウイルス剤の標的として、ウイルス固有の遺伝子であるVprとNefに着目している。これらの遺伝子機能を阻害する化合物を同定することで、効果的な抗HIV活性を持つプロドラッグが開発されると期待できる。
研究方法
Vprによる染色体不安定性亢進機構の解析：細胞にVpr発現系を導入し光顕下での細胞の観察、およびFACSによる解析を行った。
VprとNPM相互作用の解析: 相互作用の解析にはGST-pull down法を用いた。局在は蛍光顕微鏡で観察した。
AXINに関する解析: アポトーシスはAnnexinVとDNAの断片化により評価した。
NefとVpuの変異体導入によるウイルス感染性低下機構の解析: 細胞にHIVの感染性クローンを導入し、そこから産生されたウイルスの感染性を評価した。
結果と考察
VprとNPMのin vitroとin vivoでの結合性を前年度に確認している。この相互作用にはVprの中心領域とNPMのC末領域が関与していることを、GST-pull down法で確認した。また、NPMは単独発現では核内、および細胞質中のcentrosomeに局在するが、Vprとの共発現により核膜周辺に蓄積することが観察された。CV1細胞ではVprの発現によりG2/M期細胞周期停止の他にアポトーシスが誘導されるが、アポトーシスを逃れた細胞では多核化や巨核形成が認められる。NPMを過剰発現させることで、これらの効果が低減した。一方NPMをRNAiで発現抑制すると、Vpr単独発現に比べると程度は弱いが、核の異数化やアポトーシス誘導が確認された。
本年度はVpr-AXIN相互作用の生理的意義を検討し、Wnt経路の活性化が、T細胞の活性化と同時に、VprによるG2/M期細胞周期停止とアポトーシス誘導を解除することを見いだした。
VpuのC末欠失変異体はCD4の発現抑制能を欠き、この変異体を発現させた細胞に野生型HIV-1を導入すると、CD4の発現抑制が顕著に阻害され、さらにウイルス粒子の感染性が低下した。
結論
Vprによる細胞増殖性への影響の一部が、NPM機能阻害による可能性が示された。また、AXINに関しては、T細胞活性化時にVprの効果を負に制御するレギュレーターである可能性を示した。さらにVpuやNefによるCD4発現抑制が、ウイルスの感染性維持に重要であり、有望な抗ウイルス剤の標的であることが示された。

公開日・更新日

公開日
2007-03-27
更新日
-

文献情報

文献番号
200500996B
報告書区分
総合
研究課題名
ＨＩＶ－１制御遺伝子を標的とした新規抗ウイルス剤開発
課題番号
H16-創薬-009
研究年度
平成17(2005)年度
研究代表者(所属機関)
酒井　博幸(京都大学ウイルス研究所)
研究分担者(所属機関)
研究区分
厚生労働科学研究費補助金 健康安全確保総合研究分野 創薬等ヒューマンサイエンス総合研究
研究開始年度
平成16(2004)年度
研究終了予定年度
平成17(2005)年度
研究者交替、所属機関変更
-

研究報告書（概要版）

研究目的
この研究課題では抗HIV剤の標的として、ウイルスの制御遺伝子であるVprとNefの機能に着目した。これらの機能を阻害する化合物を同定・設計することで、新規の抗HIV活性を持つプロドラッグが開発されると期待できる。新規の抗ウイルス剤を既存のHAART法に取り入れることで、より効果的にHIV-1の複製を抑えることが可能となる。
研究方法
Vprの作用標的：Vprの作用標的はイーストを用いたtwo-hybrid systemを利用して同定した。in vitroでの相互作用は、免疫沈降やGST-融合蛋白を用いたpull-down法を用いて検討した。Vprの細胞機能への影響はFACSを用いた細胞周期、およびapoptosisの解析や光顕下での観察によって調べた。
NefとVpu機構の解析: HeLa細胞にHIVの感染性クローンを導入し、そこから産生されたウイルスの感染性をリポーター細胞により評価した。細胞内のCD4発現はFACS、および免疫染色法により解析した。
結果と考察
Vprと相互作用する細胞性因子としてhAXINとNPM（nucleophosmin M, B23）を同定した。hAXINはWnt/β-catenin経路に関わるscafolf蛋白と考えられ、Vprとの相互作用によってβｰcatenin経路の活性化が誘導された。またhAXINの過剰発現により、Vprによるアポトーシス誘導とG2/M期増殖停止活性が減弱した。NPMに関しては、NPMを過剰発現させることで、Vprによるアポトーシス誘導と多核化・巨核化が低減した。一方NPMをRNAiで発現抑制すると、Vpr単独発現に比べると程度は弱いが、核の異数化やアポトーシス誘導が確認された。
Nefによる細胞表面のCD4発現抑制は、主に重感染阻止に機能していることが明らかとなり、この重感染阻止は感染性粒子産生に重要であることが示された。VpuのC末欠失変異体はCD4の発現抑制能を欠き、この変異体を発現させた細胞に野生型HIV-1を導入すると、CD4の発現抑制が顕著に阻害され、さらにウイルス粒子の感染性が低下した。
結論
Vprによる細胞増殖性への影響の一部が、NPM機能阻害による可能性が示された。また、AXINに関しては、T細胞活性化時にVprの効果を負に制御するレギュレーターである可能性を示した。さらにVpuやNefによるCD4発現抑制が、ウイルスの感染性維持に重要であり、有望な抗ウイルス剤の標的であることが示された。

公開日・更新日

公開日
2007-03-27
更新日
-

行政効果報告

文献番号
200500996C