ＨＩＶ－１およびインフルエンザウイルスのゲノムＲＮＡ核外輸送機構の解明に基づく創薬

文献情報

• 文献番号: 200500988A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: ＨＩＶ－１およびインフルエンザウイルスのゲノムＲＮＡ核外輸送機構の解明に基づく創薬
• 課題番号: H16-創薬-107
• 研究年度: 平成17(2005)年度
• 研究代表者(所属機関): 高橋 秀宗(国立感染症研究所感染病理部)

研究分担者(所属機関)

• 飛梅　実(国立感染症研究所)
• 松田　道行(京都大学大学院医学研究科)
• 森山　雅美(イムノヘルスジャパン)
• 山口　靖雄(大道産業)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 健康安全確保総合研究分野 創薬等ヒューマンサイエンス総合研究
• 研究開始年度: 平成16(2004)年度
• 研究終了予定年度: 平成18(2006)年度
• 研究費: 9,900,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

HIV-1のゲノムRNAの核外輸送を含む複製を蛍光共鳴エネルギー移動 (FRET)を応用した分子プローブを使って観察し、新規抗ウイルス薬開発の標的としていくことを目的とした。

研究方法

①新たな国産蛍光蛋白質、AG(アザミグリーン)とKO(クサビラオレンジ）を用いてCrm1、Revのプローブを作成した。またHIV-1 Gag、topoisomerase I(topoI)はCFP、YFPを用いて作成した。
②蛍光蛋白の細胞内局在は倒立型蛍光顕微鏡または共焦点レーザー顕微鏡の画像を取り込み専用ソフトを用いて解析を行った。
③CRM1-AG、mKO2L-Rev共発現細胞、および恒常活性化型Ranを発現している細胞を用いてレプトマイシンB添加後、FRETをセルソーターにより検出した。

結果と考察

①RevまたはCrm1単独発現細胞で、Rev, Crm1の多くは細胞質に局在し、Revは一部核小体にCrm1は一部核膜に局在する様子が観察された。Gag-CFPは細胞質、細胞膜に多く局在していることが観察され、topoI-YFPは主に核小体を中心として核内に存在することが観察された。
②セルソーターを用いて、レプトマイシンB処理前後のFRET効率を比較したところ、Crm1-AG、KO-Rev発現細胞のFRET効率は低下したが、恒常活性化型Ran存在下においては変化を検出できなかった。
③Gag-CFP(MA)とtopoI-YFPを共発現させ、細胞膜近傍をフォトブリーチしたところ、YFPの蛍光のみが褪色することが確認された。

AGとKOという国産蛍光タンパク質を用いて、RevとCrm1の２分子FRETをセルソーターで十分に検出することができた。恒常活性化型Ran存在下で、レプトマイシンBの効果が検出されなかった理由について、強固となった複合体を阻害することができないためと考えた。
　　フォトブリーチの結果は、topoIとGagを含む複合体がウイルスゲノムの輸送、ウイルス複製に関与している可能性も考えられた。

結論

FRETを応用しウイルスRev、Gag、宿主Crm1、topoIのプローブを作成し、FRETを観察することができた。Rev, Crm1は新しく国産蛍光蛋白質を用いることにより、多細胞数を同時に扱えるフローサイトメトリーで解析する系を確立することができ、さらにレプトマイシンＢによる阻害を詳細に解析することができた。

公開日・更新日

• 公開日: 2006-05-30
• 更新日: -