インフルエンザ治療型単鎖抗体の開発に関する研究

文献情報

• 文献番号: 200500971A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: インフルエンザ治療型単鎖抗体の開発に関する研究
• 課題番号: H16-創薬-085
• 研究年度: 平成17(2005)年度
• 研究代表者(所属機関): 浅沼 秀樹(東海大学 工学部・生命化学科)

研究分担者(所属機関)

• 山口　陽子(東海大学　工学部・生命化学科)
• 橋口　一弘(北里研究所病院)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 健康安全確保総合研究分野 創薬等ヒューマンサイエンス総合研究
• 研究開始年度: 平成16(2004)年度
• 研究終了予定年度: 平成17(2005)年度
• 研究費: 3,600,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

　インフルエンザは表面抗原が変化するため、現行のワクチンでは防御が難しい。さらに近年、トリ由来の強毒株(H5型)のヒトへの致死的感染も確認されている。そのため変異株が流行した場合には症状の軽減、流行地域の縮小のために感染者の早期診断および治療が必要となる。本研究では昨年度より遺伝子技術を応用したファージディスプレイ法を用い、様々なインフルエンザウイルス抗原と結合性を有するファージ提示型単鎖抗体(scFv)ライブラリーの作製、およびscFvを用いた治療法の開発を目標としている。

研究方法

・ファージディスプレイ法を用いた抗PR8-scFvおよびFabの作製
　scFvはVLおよびVHを、FabはそれにCH1およびCL遺伝子をベクターに組み込み、トランスフォーム後、ヘルパーファージで発現させる。それをインフルエンザ抗原でパニングを行った。
・交叉防御効果判定のための実験系の確立
　ヒトインフルエンザウイルス株をマウスで馴化した。初期株をマウスに免疫後、馴化株を感染させ、完全な感染阻止を示した場合、抗原性の変化はないとした。この馴化株を用い、ワクチン接種マウスに感染させる実験系を構築した。

結果と考察

　ヒトscFvをインフルエンザ抗原でパニングを繰り返し行なった結果、陽性クローンが消失した。また、抗PR8ハイブリドーマより作製したscFvは完全な抗体と比較し、著しく結合力が低下した。このことから、scFvにすることにより、抗原との結合力が著しく低下することが示唆される。また、抗PR8-Fabも完全な抗体と比較すると結合力は低いが、部分的に抗ウイルス作用をあり、また変異株に対する交叉反応性も有していた。このことから、CH1およびCL分子を付加させることにより、部分的に結合力が増強されることが示唆された。
　本年度は新たにヒトインフルエンザ2株の馴化に成功した。またその中でA/Pについて交叉防御効果の検討を行なったところ、PR8株とA/Y株の中間的な抗原性を発現していることが明らかとなった。またこの株を用いて交叉防御効果の判定を行なうことが可能であることも明らかとなった。

結論

　scFvについては抗原との結合力の低下が著しく、陽性クローンのスクリーニングには大量のクローンを用いる必要がある。しかしFabにすることにより結合力が増強されるのであれば、こちらを使用することも視野に入れる必要がある。一方、ヒトインフルエンザ株の馴化および評価実験系の構築はできたため、本実験系を用いて今後scFvおよびFabの評価を行なう。

公開日・更新日

• 公開日: 2006-05-15
• 更新日: -

文献情報

• 文献番号: 200500971B
• 報告書区分: 総合
• 研究課題名: インフルエンザ治療型単鎖抗体の開発に関する研究
• 課題番号: H16-創薬-085
• 研究年度: 平成17(2005)年度
• 研究代表者(所属機関): 浅沼 秀樹(東海大学 工学部・生命化学科)

研究分担者(所属機関)

• 山口　陽子(東海大学　工学部・生命化学科)
• 橋口　一弘(北里研究所病院)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 健康安全確保総合研究分野 創薬等ヒューマンサイエンス総合研究
• 研究開始年度: 平成16(2004)年度
• 研究終了予定年度: 平成17(2005)年度
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

　インフルエンザは表面抗原が変化するため現行のワクチンでは防御が難しい。さらに近年、トリ由来の強毒株の致死的感染も確認されている。そのため変異株が流行した場合には症状の軽減だけでなく、感染者の早期診断ならびに早期治療が必要となる。本研究では遺伝子技術を応用した蛋白創生技術であるファージディスプレイライブラリー法を用い、様々なインフルエンザウイルス抗原と結合性を有するファージ提示型単鎖抗体(scFv)ライブラリーの作製、およびscFvを用いた治療法の開発を目標とする。

研究方法

・ファージディスプレイ法を用いた抗PR8-scFvとFabの作製
　scFvはVL、VH遺伝子を、FabはそれにCH1、CL遺伝子をベクターに組み込み発現させ、インフルエンザ抗原でパニングを行った。
・交叉防御効果判定のための実験系の確立
　ヒトインフルエンザウイルス株をマウスで繰り返し継代感染させ馴化した。初期株をマウスに免疫後、馴化株を感染させ、完全な感染阻止を示した場合、抗原性の変化はないとした。
・A/Peking株に対する交叉防御効果の検討
　マウスにPR8ワクチンを経鼻接種し、様々な株を感染させ3日後、鼻腔、肺洗浄液を回収しウイルス価と抗体価を測定した。

結果と考察

　ヒトscFvをインフルエンザ抗原でパニングを繰り返し行なった結果、陽性クローンが消失した。また、抗PR8ハイブリドーマより作製したscFvは完全な抗体と比較し、著しく結合力が低下した。このことから、scFvにすることにより、抗原との結合力が著しく低下することが示唆される。また、抗PR8-Fabも完全な抗体と比較すると結合力は低いが、一部には抗ウイルス作用を有し、さらに変異株と交叉反応性も有するクローンも認められた。このことから、CH1およびCL分子を付加させることにより、scFvよりも部分的に結合力が増強されることが示唆された。
　ヒトインフルエンザ5株のマウスへの馴化を試み、それら全ての馴化に成功した。またその中でA/Pについて交叉防御効果の検討を行なったところ、PR8株とA/Y株の中間的な抗原性を発現していることが明らかとなった。またこの株を用いて交叉防御効果の判定を行なうことが可能であることも明らかとなった。

結論

　scFvについては抗原との結合力の低下が著しいため、陽性クローンのスクリーニングに大量のクローンを用いる必要がある。しかしFabにすることにより結合力が増強されるのであれば、こちらの使用も視野に入れる必要がある。一方、ヒトインフルエンザ株の馴化と評価実験系の構築はできたため、今後scFvおよびFabの評価が可能となった。

公開日・更新日

• 公開日: 2006-05-15
• 更新日: -

行政効果報告

• 文献番号: 200500971C

成果

• 専門的・学術的観点からの成果: 抗インフルエンザscFvおよびFabをファージディスプレイ法により作製した。scFvにすることで抗原との結合力が著しく低下したが、FabではmAbよりも結合力の低下が認められたが、scFvのそれよりも高いことが示唆された。また本分子の有効性を評価するための動物実験系の確立のため、いくつかのヒトインフルエンザ株のマウスへの馴化とそれを用いた交叉反応性について検討し有効な結果が得られた。
• 臨床的観点からの成果: 本分子の最終目標はインフルエンザの変異株の流行に迅速に対応できる薬剤の開発である。その初期段階としての分子の作製には成功した。しかしFabの有効性は確認されたが、scFvの有効性は確認されなかった。そのためFabについては今後の動物実験による有効性が確認され次第、臨床応用を検討する。一方scFvについては分子の特性等の詳細な検討が必要である。
• ガイドライン等の開発: 特になし
• その他行政的観点からの成果: 現在トリインフルエンザのヒトへの致死的感染が確認され、インフルエンザの変異株に対する早急な対応が望まれている。このような行政的な対策に本分子の開発は合致しているが、臨床応用までには動物実験での有効性等、多くの問題点の解決が必要である。
• その他のインパクト: 特になし

発表件数

• 原著論文（和文）: 0件
• 原著論文（英文等）: 0件
• その他論文(和文): 0件
• その他論文(英文等): 0件
• 学会発表(国内学会): 2件
• 学会発表(国際学会等): 0件
• その他成果(特許の出願): 0件 ; 「出願」「取得」計0件
• その他成果(特許の取得): 0件
• その他成果(施策への反映): 0件
• その他成果(普及・啓発活動): 0件

公開日・更新日

• 公開日: 2015-05-26
• 更新日: -