食品由来のウイルス性感染症の検出法の高度化、実用化に関する研究

文献情報

• 文献番号: 200500656A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: 食品由来のウイルス性感染症の検出法の高度化、実用化に関する研究
• 課題番号: H15-新興-013
• 研究年度: 平成17(2005)年度
• 研究代表者(所属機関): 武田 直和(国立感染症研究所 ウイルス第二部)

研究分担者(所属機関)

• 田中　智之(堺市衛生研究所)
• 谷口　孝喜(藤田保健衛生大学医学部)
• 榮　賢司(愛知県衛生研究所微生物学部)
• 大瀬戸　光明(愛媛県立衛生環境研究所)
• 篠崎　邦子(千葉県衛生研究所)
• 斎藤　博之(秋田県衛生科学研究所)
• 松岡　由美子(熊本市環境総合研究所)
• 勢戸　祥介(大阪府立大学大学院)
• 西尾　治(国立感染症研究所)
• 岡　智一郎(国立感染症研究所)
• 白土　東子(国立感染症研究所)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 新興・再興感染症研究
• 研究開始年度: 平成15(2003)年度
• 研究終了予定年度: 平成17(2005)年度
• 研究費: 13,200,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

患者便、血清、環境からの下痢症ウイルス抗原検出において、迅速性、簡便性、効率の向上を計る。
原因食品からの下痢症ウイルス抗原定量法を確立する。検査材料別に下痢症ウイルス検査法を確立しその検出限界を明らかにする。

研究方法

組換えバキュロウイルスを用いてノロウイルス（NoV）中空粒子（VLPs）を作製し、単クローン抗体およびポリクローン抗体を用いたNoV抗原検出ELISA を構築した。ジェノグループI（GI）、GIIを特異的に認識する単クローン抗体を用いイムノクロマト診断キットを構築した。NoV VLPsを抗原としたELISAでNoVの血清疫学を行った。SSCP解析を活用してNoVを同定した。A、B、Lea、Leb型抗原とNoV VLPsとの結合をELISAで測定した。動物細胞でSaV VLPsを作製した。VP6の共通抗原に反応する単クローン抗体を用いて、血清中のVP6をELISAで検出した。

結果と考察

GI で 6株、GIIで 20株、合計26株の抗原および抗血清を作製した。血清学的にはGIで6種、GII で12種、計18種である。NoV抗原検出ELISAが実用の域に達した。NoV VLPsと抗血清の成績を基に、迅速かつ簡便なNoV診断ICキットを構築した。分子疫学研究から、GIIが流行の主役であること、わが国でもGII/4 に遺伝子の変化が起こっていることが示された。NoVを多数解析するうえでのSSCPの有効性を明らかにし、井戸水に起因する食中毒事例を解析した。NoVの結合には型物質が重要であるが、型物質以外の因子を必要とするNoVもあることを示した。動物細胞を用いてSaV VLPsを効率よく作製する方法を確立した。ELISAによるロタウイルス抗原検出法を確立した。

結論

NoV抗原検出ELISAを確立し、診断薬としての認可を得た。単クローン抗体を用いNoVイムノクロマト診断キットを構築した。感度、特異性についてデータを集め、実用化を目指す。NoV GII/4 の遺伝子の変化と、老人施設、障害者施設、病院での集団発生の増加との関連性の可能性が推測された。NoVを多数解析するうえでのSSCPが有効であった。NoVの結合には型物質が重要であるが、型物質以外の因子を必要とするNoVもあった。環境からのNoVによる感染症・食中毒が急増している。井戸水などの原水が汚染される可能性がある。ヒトロタウイルス感染の急性期において、かなり普遍的に抗原血症が起きていることが明らかとなった。

公開日・更新日

• 公開日: 2006-04-10
• 更新日: -

文献情報

• 文献番号: 200500656B
• 報告書区分: 総合
• 研究課題名: 食品由来のウイルス性感染症の検出法の高度化、実用化に関する研究
• 課題番号: H15-新興-013
• 研究年度: 平成17(2005)年度
• 研究代表者(所属機関): 武田 直和(国立感染症研究所 ウイルス第二部)

研究分担者(所属機関)

• 田中　智之(堺市衛生研究所)
• 谷口　孝喜(藤田保健衛生大学医学部)
• 栄　　賢司(愛知県衛生研究所微生物学部)
• 大瀬戸　光明(愛媛県立衛生環境研究所)
• 篠崎　邦子(千葉県衛生研究所)
• 斎藤　博之(秋田県衛生科学研究所)
• 松岡　由美子(熊本市環境総合研究所)
• 勢戸　祥介(大阪府立大学)
• 入谷　展弘(大阪市立環境科学研究所)
• 西尾　治(国立感染症研究所感染症情報センター)
• 名取　克郎(国立感染症研究所　ウイルス第二部)
• 片山　和彦(国立感染症研究所　ウイルス第二部)
• 岡　智一郎(国立感染症研究所　ウイルス第二部)
• 白土　東子(国立感染症研究所　ウイルス第二部)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 新興・再興感染症研究
• 研究開始年度: 平成15(2003)年度
• 研究終了予定年度: 平成17(2005)年度
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

遺伝子増幅による定量法を確立するとともに、免疫学的手法を用いた濃縮法を導入し、検出効率の向上を目指す。環境からの抗原検出には生化学、電気化学的手法で濃縮を行う個々のウイルスについてその検査材料別に検査法を把握しその検出限界を明らかにする。イムノクロマトによる抗原検出系を確立し、NoVベッドサイド迅速診断法を確立する。

研究方法

組換えバキュロウイルスを用いてノロウイルス（NoV）中空粒子（VLPs）を作製し、NoV抗原検出ELISA を構築した。ジェノグループI（GI）、GIIを特異的に認識する単クローン抗体を用いイムノクロマト診断キットを構築した。NoV VLPsを抗原としたELISAでNoVの血清疫学を行った。SSCP解析を活用してNoVを同定した。A、B、Lea、Leb型抗原とNoV VLPsとの結合をELISAで測定した。動物細胞でSaV VLPsを作製した。ファージディスプレイ法により抗HRV抗体を作製した。VP6の共通抗原に反応する単クローン抗体を用いて、血清中のVP6をELISAで検出した。その他、ウイルス性下痢症検査マニュアル（第3版）を参照した。

結果と考察

GI で 6株、GIIで 20株、合計26株の抗原および抗血清を作製し、NoV抗原検出ELISAを開発した。NoV診断ICキットを構築した。GIIが流行の主役であり、わが国でもGII/4 に遺伝子の変化が起こっていた。NoVを多数解析するうえでSSCPが有効であった。NoV全長cDNA クローンを用いて複製機構を解析した。NoVの結合には型物質が重要であるが、型物質以外の因子を必要とするNoVもあった。動物細胞を用いてSaV VLPsを効率よく作製する方法を確立した。ELISAによるロタウイルス抗原検出法を確立した。磁気ビーズを用いたNoV、AiV検出法を確立した。

結論

NoV抗原検出ELISAを確立し、診断薬としての認可を得た。単クローン抗体を用いNoVイムノクロマト診断キットを構築した。NoV GII/4 の遺伝子の変化と、老人施設、障害者施設、病院での集団発生の増加との関連性の可能性が推測された。NoVを多数解析するうえでのSSCPが有効であった。NoVの結合には型物質が重要であるが、型物質以外の因子を必要とするNoVもあった。ウイルス性下痢症検査マニュアル（第3版）を作製した。カリシウイルスデータベースを構築した。

公開日・更新日

• 公開日: 2006-04-05
• 更新日: -

行政効果報告

• 文献番号: 200500656C

成果

• 専門的・学術的観点からの成果: ジェノグループI で 6株、ジェノグループIIで 20株、合計26株の抗原および抗血清を作製し、抗原性の差を明らかにした。これによって、これまでの分子系統解析で行なわれてきた遺伝学的差異との比較が可能となり、分類学上の基礎が確立できた。
• 臨床的観点からの成果: リアルタイムRT-PCRによるノロウイルス定量法を確立するとともに、免疫磁気ビーズ法によって食品からノロウイルスを濃縮精製し、高感度で検出する手法を確立した。抗原検出ELISAを確立し、診断薬としての認可を得ることができた。これによって、安価で迅速な診断が可能になった。
• ガイドライン等の開発: ウイルス性下痢症検査マニュアル（第3版）を作成した。国立感染症研究所のホームページ（http://www.nih.go.jp/niid/reference/index.html）に掲載されている。
• その他行政的観点からの成果: 厚生労働省ホームページ、ノロウイルスに関するＱ＆Ａ; （http://www.mhlw.go.jp/topics/syokuchu/kanren/yobou/040204-1.html）の作成と改正に役立った。
• その他のインパクト: なし

発表件数

• 原著論文（和文）: 11件
• 原著論文（英文等）: 49件
• その他論文(和文): 19件
• その他論文(英文等): 1件
• 学会発表(国内学会): 47件
• 学会発表(国際学会等): 18件
• その他成果(特許の出願): 0件 ; 「出願」「取得」計0件
• その他成果(特許の取得): 0件
• その他成果(施策への反映): 2件
• その他成果(普及・啓発活動): 0件

主な原著論文20編（論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限る）

• 原著論文1: Hansman GS, Natori K, Oka T et al.; Cross-reactivity among sapovirus recombinant capsid proteins; Arch. Virol. , 150 , 21-36 (2005)
• 原著論文2: Hansman GS, Kuramitsu M, Yoshida H et al.; iral gastroenteritis in Mongolian infants; Emerg. Infect. Dis. , 11 , 180-182 (2005)
• 原著論文3: Hansman GS, Katayama K, Oka T et al.; Mutational study of sapovirus expression in insect cells; Virol. J , 2 , 13- (2005)
• 原著論文4: Kamata, K., Shinozaki, K., Okada, M et al.; Expression and antigenicity of virus-like particles of Norovirus and their application for detection of Noroviruses in stool samples; J. Med. Virol. , 76 , 129-136 (2005)
• 原著論文5: Okada M, Ogawa T, Kaiho I; Genetic analysis of noroviruses in Chiba Prefecture, Japan, between 1999 and 2004; J. Clin. Microbiol. , 43 , 4391-4401 (2005)
• 原著論文6: Oka T., Katayama K., Ogawa S; Proteolytic Processing of Sapovirus ORF1 Polyprotein; J. Virol , 79 , 7283-7290 (2005)
• 原著論文7: Hansman GS., Matsubara N., Oka T et al.; Deletion analysis of the Sapovirus VP1 gene for the assembly of virus-like particles; Arch. Virol. , 150 , 2529-2538 (2005)
• 原著論文8: Oka T., Katayama K., Ogawa S.; Cleavage activity of the Sapovirus 3C-like protease in Escherichia coli.; Arch. Virol. , 150 , 2539-2548 (2005)
• 原著論文9: Hansman GS., Takeda N., Oka T.; Intergenogroup recombination in sapoviruses.; Emerg. Infect. Dis. , 11 , 1916-1920 (2005)
• 原著論文10: 18. Oka T., Hansman GS., Katayama K.; Expression of sapovirus virus-like particles in mammalian cells.; Arch. Virol. , 151 , 399-404 (2006)
• 原著論文11: Wu FT., Oka T., Katayama K. et al.; Genetic diversity of noroviruses in Taiwan between November 2004 and March 2005. ; Arch. Virol in press (2006)
• 原著論文12: 20. Hansman GS., Natori K., Shirato-Horikoshi H. et al.; Genetic and antigenic diversity among noroviruses.; J. Gen. Virol. , 87 , 909-919 (2006)
• 原著論文13: Katayama K., Hansman GS., Oka T. et al.; Investigation of Norovirus replication in a human cell line.; Arch. Virol. in press (2006)
• 原著論文14: Hansman GS, Katayama K ，Maneekarn N et al.; Genetic Diversity of Norovirus and Sapovirus in Hospitalized Infants with Sporadic Cases of Acute Gastroenteritis in Chiang Mai, Thailand.; J. Clin. Microbiol. , 42 , 1305-1307 (2004)
• 原著論文15: Hansman GS, Doan LT, Kguyen TA et al.; Detection of norovirus and sapovirus infection among children with gastroenteritis in Ho Chi Minh City, Vietnam.; Arch. Virol. , 149 , 1673-1688 (2004)
• 原著論文16: Katayama K, Miyoshi T, Uchino K et al.; Novel Recombinant Sapovirus.; Emerg. Infect. Dis. , 10 , 1874-1876 (2004)
• 原著論文17: Guntapong R, Hansman GS, Oka T et al.; Norovirus and Sapovirus Infection in Thailand.; Jpn. J. Infect. Dis. , 57 , 276-278 (2004)
• 原著論文18: Tamura M, Natori K, Kobayashi M et al.; Genogroup II noroviruses efficiently bind to heparan sulfate proteoglycan associated with the cellular membrane.; J. Virol. , 78 , 3817-3826 (2004)
• 原著論文19: Tamura M, Natori K, Kobayashi M et al.; Inhibition of attachment of virions of Norwalk virus to mammalian cells by soluble histone molecules.; Arch. Virol. , 148 , 1659-1670 (2003)

公開日・更新日

• 公開日: 2016-06-27
• 更新日: -