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文献情報

文献番号 200200820A
報告書区分 総括
研究課題 リウマチアレルギー疾患の早期診断に関する研究(総括研究報告書)
課題番号  
研究年度 平成14(2002)年度
研究代表者(所属機関) 白川太郎(京都大学大学院医学研究科) 
研究分担者(所属機関) 清野宏(東京大学医科学研究所),出原賢治(佐賀医科大学医学部),古賀泰裕(東海大学医学部),園元謙二(九州大学農学研究院),中山二郎(九州大学農学研究院),小泉昭夫(京都大学大学院医学研究科) 
研究区分 厚生労働科学研究費補助金 先端的厚生科学研究分野 免疫アレルギー疾患予防・治療研究
開始年度 平成13(2001)年度
終了予定年度 平成15(2003)年度
研究費 18,000,000円
研究者交替、所属機関変更  

研究報告書(概要版)

概要版 研究目的:
アレルギー疾患はいずれの年齢でも発症し、旧厚生省特別研究班の調査でも国民の38%が罹患する最も頻度の高い生活習慣病であり、国民のQOLの立場から特に重要な疾患である。特に小児における罹患率が増加し、小児の死亡の重要原因であり、また小児救急医療費の30%以上を占めることからその予防は厚生労働行政の急務であると考えられる。其の予防のためには出産直後からの早期診断が必要であるが、個体が小さく頻繁に血液検査などの検査を行うことは成人と異なり容易ではない。乳児期の免疫系は主として消化管において形成されると考えられ、その形成には消化管の細菌相の形成が重要であると考えられている。したがって消化管細菌相と免疫能がアレルギー疾患発症児童では正常児童と成長につれどのように異なるのかを明らかにすることはアレルギーの発症機序を明らかにし、その予防対策を構築する上で必要であると考えられる。13年度には以上の目的を達成するため、(1)便中の細菌の分子遺伝学的な検査を行う、(2)腸管免疫系のマウスにおける実験モデルの確立、(3)ヒト個体のアレルギー疾患関連遺伝子解析の開始、そして(4)腸内細菌とアレルギーとの関連依関しての疫学調査の準備を行ってきた。そこで14年度では、13年度での成果を踏まえて、便中の細菌検査における実際のマイクロアレイ法開発に向けた研究開発を行うと共に、モデル動物を用いた細菌と腸管免疫系の動きを腸管上皮細胞内遺伝子の動きを解析することでヒト個体での遺伝子解析とドッキングさせる試みを行い、早期診断法の確立に向けた実質的な解析を行った。
研究方法:
1. 早期診断に向けての疫学調査:血清における診断法確立の対象者は、国立療養所南福岡病院の小児科受診の男女(3歳〜5歳)であり、主に、喘息とアトピー性皮膚炎の児童を対象に血液サンプルと保護者を対象にした質問紙を実施している。質問紙の内容は、環境要因、アレルギー症状の家族歴、などであった。血清の測定項目は、IgE抗体価、抗腸内細菌(Escherichia coli, Bacteroides vulgatus, Enterococcus faecalis, Bifidobacterium longun, Staphyloccal enterotoxin A)IgG抗体価、生物・食品・真菌などのIgE抗体価である。一方、大規模な追跡調査を行う目的で@人口の入れ替わりが少ない地域であること(追跡調査が可能であること)、A健康への取り組みが熱心であること、B大気汚染その他の、他の発症要因が少ない地域であること、C年間の新生児誕生がある程度見込める地域であること、などの条件を満たす地区として、熊本県小国町を選定した。 2. マウスにおける解析:腸内細菌を再建したマウスにwild type とmutant typeの病原性大腸菌を感染させ産生されるOVA特異的なIgG抗体の差について検討を行う。この免疫能は消化管のリンパ節に依存すると言われておりTNFおよびLTの受容体を欠損させたマウスによるリンパ節の発生とIgA抗体の産生についてもあわせて観察した。一方、消化管免疫能と細菌との関係の検討おけるIL-13及びその受容体の発現と疾患感受性との関連について検討を行うためOVAによる喘息モデル動物を作成し、IL-13やIL-4により誘導される遺伝子群の動きを肺組織のRT-PCRを行って同定した。 3. 便の細菌相の検索:福岡市内の井槌産婦人科医院での新生児を対象にして、入院1週間の便と退院後の1箇月毎の便の収集を行い、九大農学部で処理され細菌16sRNAcDNAを抽出してライブラリーを作成した。 4. ヒトアレルギー関連遺伝子解析:理化学研究所SRCセンター及び京都大学において、正常対照287名、小児喘息例284例、成人喘息例384例を収集して全ゲノムSNP解析を行った。対象SNPは遺伝子コード部分約100,000個を対象とした。 5. 倫理審査:本研究を遂行するにあたり、対象とする乳児の臨床データの収集と採血に当たっては担当医師から統一のinformed consentを配布し、両親にこの研究の不利益、危険性の排除に関する考慮、必要性と有用性を充分説明して同意を得た場合に限り研究を実施する。その後のデータは全て連結可能なID化を行い、匿名化しておく。遺伝子解析及び個人情報採取に当たってはヒトゲノム・遺伝子解析研究に関する倫理指針等を遵守することとし、動物実験も含め当該施設における倫理委員会での審査を受けることとした。
結果と考察:
1. 疫学調査の開始:160名(アトピー性皮膚炎80名、喘息80名)を目標にサンプルを収集中である。現在、84名分の血液中IgE抗体価、特異的IgE抗体価の測定が終了している。平均IgE値は、1353IU/mlであった。ダニに対する100UA/ml以上のIgE抗体価をもつ児童は、51名で全体の60%以上にのぼった。一方、大規模疫学調査として、今年度7月下旬より、プロバイオティクスを製造している3企業をオブザーバーに迎え小国町を中心とした研究会を立ち上げた。研究会委員には、町の代表者を迎え、試験内容の理解を深めるとともに、アンケート調査などを中心にして町民に啓蒙活動を行った。第四回研究会では、オブザーバーによる、プロバイオティクスのアレルギー予防効果試験の提案が行われ、次年度以降の試験準備を整えた。 2.再建マウスによる免疫寛容誘導:再建マウスにおける感染実験でWild type 病原大腸菌EPEC株(WT)の、Tirあるいは遺伝子を欠拐させたEPEC株(ΔTir)に対するIgG抗体による経口免疫寛容は誘導が困難となった。一方、IgA抗体の誘導はこれらに差がなく、腸内細菌による免疫寛容に差が見られることから、消化管にあれるアレルギー反応の阻止に腸内細菌が重要な役割を果たしている可能性が示唆された。 3. 腸管における免疫におけるリンパ節の重要性:前年度での研究からLTβR-Ig処理をした妊娠マウスから生まれた産仔マウスではパイエル板が欠損していた。そこで今年度は粘膜免疫の主役であるIgA産生系について検討すると、パイエル板欠損マウスでは抗原特異的なIgA産生は著名に減少しており、リンパ節でのT細胞、B細胞の協会が不明瞭となっていた。従って粘膜免疫で重要なIgA抗体産生のためには消化管リンパ節、特にパイエル板が重要でありその形成にサイトカインが重要な役割を担っていることが判明した。 4.腸管におけるTH2サイトカインの役割:前年度では組織染色によりIL-4とIL-13のレセプター構成成分の発現を解析したところ,胃と小腸のどちらの組織においても上皮細胞の中の小窩細胞,腺細胞においてレセプターの発現が認められた。今年度はさらに喘息モデル動物での肺組織での解析を行い、これらのサイトカインによる誘導遺伝子を同定した後、喘息モデル動物での解析で7個の興味ある遺伝子を同定した。これらの遺伝子の動向がアレルギー腸炎モデルマウスで度のようになっているか解析中である。 5. アトピー遺伝子の解析:前年度に引き続き約10,000個のSNP(1塩基置換)を比較して有意に頻度に差のあるSNPが最終的に37個程度発見された。 6. 便のマイクロアレイ診断法の確立:36名の新生児の便につき約260クローンを抽出し、配列解析を行った。その結果、39種類の菌を同定した。その結果、16SrDNAによるライブラリーの作製は可能であり、大部分の細菌が診断可能であることが裏付けられた。
結論:
以上の結果から、新生児以降の免疫の発達にはリンパ節が重要な役割を担っており、またそれらのリンパ節でのサイトカインの産生能には遺伝的な差異があることが分かる。一方、その免疫を誘導する因子として消化管における細菌相の発育が消化管でのアレルギー反応に重要な役割を果たしていることが明らかとなった。16SrDNA法による迅速診断法が開発可能であることが判明し、またフィールドが確定したことにより、今後、この方法を用いて大規模な疫学調査を行い、その信頼性を高める作業が可能になった。
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