新規標的に対する小分子化合物を基盤とした抗ＨＩＶ化学療法剤の開発

文献情報

• 文献番号: 201210004A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: 新規標的に対する小分子化合物を基盤とした抗ＨＩＶ化学療法剤の開発
• 課題番号: H22-政策創薬-一般-005
• 研究年度: 平成24(2012)年度
• 研究代表者(所属機関): 松岡 雅雄(京都大学 ウイルス研究所)

研究分担者(所属機関)

• 藤井　信孝(京都大学大学院　薬学研究科)
• 大石　真也(京都大学大学院　薬学研究科)
• 村上　努(国立感染症研究所　エイズ研究センター)
• 志村　和也(京都大学　ウイルス研究所)
• 栗原　秀樹(富士フイルム株式会社　R&D統括本部医薬品・ヘルスケア研究所)
• 松野　孝洋(富士フイルム株式会社　R&D統括本部医薬品・ヘルスケア研究所)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 厚生科学基盤研究分野 創薬基盤推進研究(政策創薬マッチング研究)
• 研究開始年度: 平成22(2010)年度
• 研究終了予定年度: 平成24(2012)年度
• 研究費: 28,000,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

当研究グループでは、新規抗HIV 活性化合物の探索を目的としたランダムスクリーニングを行い、ピラゾール骨格を有する化合物が高い抗HIV 活性を示すことを見出した。新規高活性誘導体の創製を目指して構造活性相関研究を展開した。また、PD 404182および高活性誘導体の作用機序を種々の評価法を用いて解析した。さらに、本化合物のマウスに対する毒性を評価した。
　また、CXCR4阻害剤に対する研究では、耐性HIV-1を誘導し、その耐性変異のパターンや耐性機構を解析することによって、次世代の治療を考慮した耐性変異パターンの予測法の確立を目的とした。

研究方法

○高活性誘導体の創製
ピラゾール骨格を有する新規抗HIV化合物の様々な誘導体を作製し、構造活性相関研究を行った。
○Time of drug addition assay
レポーター細胞にHIV-1 IIIB株を感染させ、感染後経時的にPD 404182および高活性誘導体を添加した。作用点既知の各種抗HIV薬を対照として用いた。
○作用点の解析
化合物の前処理群として、高タイターのHIV-1 IIIB粒子と100 microMのPD 404182を混合し、37℃で静置した。90分後、本混合物を1000倍希釈し、レポーター細胞に感染させた。一方、後処理群では、PD 404182の代わりに最終濃度を揃えたDMSOと同タイターのウイルス粒子を混合した。本混合物を細胞に添加する際に100 nMのPD 404182を加えた。両群とも感染48時間後にウイルス粒子の感染性を評価した。
○マウス毒性試験
日本クレアより入手したJcl:ICRマウス（雌・6週齢）に対して、PD 404182の1日1回腹腔内投与を3日連続で行った。その後1週間にわたり、体重の増減を指標として評価した。
○CXCR4阻害剤耐性HIV-1株の中和抗体感受性試験
CXCR4阻害剤耐性HIV-1株由来のEnv組換えNL4-3の中和抗体感受性を、447-52D および2F5 について評価した。

結果と考察

○高活性誘導体の創製
5-アミノピラゾール構造を有する誘導体はリード化合物に匹敵する活性を示した。本誘導体を基盤として構造活性相関研究を展開した。ピラゾールN-1位のフェニル基上の置換基効果を検討した結果、ビフェニル体に高い活性が認められた。この誘導体を基に、m-フェニル基の置換基効果を精査した結果、メタ位、もしくはパラ位にメチル基を導入した化合物やジクロロ体で活性の向上が認められ、最終的に約6倍活性が向上した高活性誘導体を得た。
○Time of drug addition assayおよび作用点の解析
PD 404182および試験に用いた全ての高活性誘導体は、いずれも吸着阻害剤であるDS5000に類似のプロファイルを示した。また、PD 404182の高濃度溶液で予め処理したHIV-1（前処理群）は、溶媒コントロールの対照群と比較して、1%以下の感染性を示した。一方、細胞感染時にPD 404182を加えたHIV-1（後処理群）は、約80%程度の感染性を有していた。
これらの解析から、PD 404182の作用点は、ウイルスの細胞への吸着過程を含む感染最初期であることが確認された。さらには、本化合物をウイルス粒子に作用させると感染を阻害するという結果からも、本化合物が選択的にウイルス粒子に存在する分子に作用して抗ウイルス活性を示していることが推測された。
○マウス毒性試験
Jcl:ICRマウスにPD 404182を30 mg/kgの用量で1日1回、3日間連続投与した結果、死亡例は認められなかった。また、その後の体重の増減も溶媒コントロールとの間に大きな差は認められなかった。
○CXCR4阻害剤耐性HIV-1株の中和抗体感受性試験
いずれのCXCR4阻害剤耐性HIV-1株由来のEnv組換えNL4-3もgp120 V3ループをエピトープとする中和抗体である447-52Dおよびgp41の膜貫通領域近傍をエピトープとする中和抗体である2F5に対する感受性が上昇していた。この結果より、実際にHIV感染者体内で今回使用したCXCR4阻害剤を投与した場合は、出現しても淘汰される可能性が示唆された。

結論

ランダムスクリーニングにより見出した抗HIV 活性を有するピラゾール誘導体の構造最適化を展開し、リード化合物に比較して約６倍強力な抗HIV活性示す誘導体を見出した。PD 404182はウイルス粒子に存在する分子に影響を与えることで、感染性を消失させていると推測された。さらには、CXCR4阻害剤耐性HIV-1株のEnv領域中のV3, V4領域に共通して認められた変異はEnvを標的とする中和抗体に対する感受性を高める変異でもあることが明らかになった。

公開日・更新日

• 公開日: 2013-08-27
• 更新日: -

文献情報

• 文献番号: 201210004B
• 報告書区分: 総合
• 研究課題名: 新規標的に対する小分子化合物を基盤とした抗ＨＩＶ化学療法剤の開発
• 課題番号: H22-政策創薬-一般-005
• 研究年度: 平成24(2012)年度
• 研究代表者(所属機関): 松岡 雅雄(京都大学 ウイルス研究所)

研究分担者(所属機関)

• 藤井　信孝(京都大学大学院　薬学研究科)
• 大石　真也(京都大学大学院　薬学研究科)
• 村上　勉(国立感染症研究所　エイズ研究センター)
• 志村　和也(京都大学　ウイルス研究所)
• 嶋田　泰宏(富士フイルム株式会社医薬品・ヘルスケア研究所)
• 前田　英樹(富士フイルム株式会社医薬品・ヘルスケア研究所)
• 谷口　雅彦(富士フイルム株式会社医薬品・ヘルスケア研究所)
• 栗原　秀樹(富士フイルム株式会社医薬品・ヘルスケア研究所)
• 松野　孝洋(富士フイルム株式会社医薬品・ヘルスケア研究所)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 厚生科学基盤研究分野 創薬基盤推進研究(政策創薬マッチング研究)
• 研究開始年度: 平成22(2010)年度
• 研究終了予定年度: 平成24(2012)年度
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

効果的な抗HIV療法において、薬剤耐性HIVの出現は、服薬が長期になるにつれて新たに露呈してきた障壁である。この問題に対処するため、既存の薬剤に耐性を示すHIVの制御が可能な新規標的に作用する阻害剤の同定が急務となっている。そこで本研究課題では、未治療標的に対する小分子化合物を基盤とした新規抗HIV化学療法剤の開発を目的とした。

研究方法

○抗HIV活性小分子化合物の創製
様々な誘導体を作製し、構造活性相関研究を行った。
○抗ウイルススペクトル解析
PD404182の抗ウイルススペクトル解析を行った。
○Time of drug addition assay
レポーター細胞に、HIV-1を感染させ、経時的にPD 404182および高活性誘導体を添加した。
○作用点の解析
HIV-1粒子と100 microMのPD 404182を混合後、1000倍希釈してレポーター細胞に感染させ、48時間後にウイルス粒子の感染性を評価した。
○PD 404182のマウス毒性試験
Jcl:ICRマウス（雌・6週齢）にPD 404182の1日1回腹腔内投与を3日連続で行った。
○CXCR4阻害剤耐性HIV-1誘導実験
4種のCXCR4阻害剤のEC50付近の濃度を初発濃度として開始し、添加する薬剤濃度を段階的に増加させ、耐性株を誘導した。
○CXCR4阻害剤耐性HIV-1株の中和抗体感受性試験
CXCR4阻害剤耐性HIV-1株由来のEnv組換えNL4-3の中和抗体感受性を評価した。

結果と考察

○抗HIV活性小分子化合物の創製
　ピリミドベンゾチアジン骨格
ヘテロ原子部位を変換した化合物では活性値が大きく減少したため、この部位が標的分子と相互作用している可能性が示唆された。ベンゼン環部位の9位及び10位に臭素原子を導入した化合物において、2倍程度の活性値の向上が認められた。従って、ピリミドベンゾチアジン骨格のベンゼン環周辺には標的物質との疎水性の相互作用が存在すると考えられる。
　ピラゾール骨格
5-アミノピラゾール構造を有する誘導体はリード化合物に匹敵する活性を示した。そこで、本誘導体をもとに構造活性相関研究を展開した。ピラゾールN-1位のフェニル基上の置換基効果を検討した結果、ビフェニル体に高い活性が認められた。この誘導体を基に、m-フェニル基の置換基効果を精査した結果、メタ位、もしくはパラ位にメチル基を導入した化合物やジクロロ体で活性の向上が認められた。
○抗ウイルススペクトル解析
PD 404182は、インフルエンザAウイルスにリバビリンと同程度の活性を示した。また、ヒト単純ヘルペスウイルス2型の複製を抑制した。一方、アデノウイルスの感染は抑制しなかった。感受性を示したウイルスはいずれもエンベロープウイルスであるが、アデノウイルスはエンベロープを有しないことから、新規抗HIV活性小分子化合物はウイルスエンベロープを標的としている可能性が示唆された。
○Time of drug addition assay
PD 404182および試験に用いた全ての高活性誘導体は、いずれも吸着阻害剤であるDS5000に類似のプロファイルを示したため、PD 404182の作用点は、ウイルスの細胞への吸着過程を含む感染最初期であると推測された。
○作用点の解析
PD 404182の高濃度溶液で予め処理したHIV-1は、溶媒コントロールの対照群と比較して、1%以下の感染性を示した。従って、本化合物が選択的にウイルス粒子に存在する分子に作用して抗ウイルス活性を示していることが推測された。
○PD 404182のマウス毒性試験
Jcl:ICRマウスにPD 404182を30 mg/kgの用量で1日1回、3日間連続投与した結果、死亡例は認められなかった。
○CXCR4阻害剤耐性HIV-1の誘導および中和抗体感受性試験
いずれのCXCR4阻害剤耐性HIV-1株由来のEnv組換えNL4-3もgp120 V3ループをエピトープとする中和抗体である447-52Dおよびgp41の膜貫通領域近傍をエピトープとする中和抗体である2F5に対する感受性が上昇していたことより、実際にHIV感染者体内で今回使用したCXCR4阻害剤を投与した場合は、出現しても淘汰される可能性が示唆された。

結論

PD 404182に関する研究では、高活性化に必要な部位を同定し、実際にリード化合物に比べ、4倍強い活性値を示す誘導体を得た。抗ウイイルススペクトル解析やtime of drug addition assayなどから、本化合物はウイルス粒子に存在する分子に影響を与えることで、感染性を消失させていると推測された。
　CXCR4阻害剤に関する研究では、阻害剤開発に有用な知見や耐性HIVの性質に関する情報が得られた。

公開日・更新日

• 公開日: 2013-08-27
• 更新日: -

行政効果報告

• 文献番号: 201210004C

成果

• 専門的・学術的観点からの成果: 本研究課題では、これまでに研究グループで見出した新規抗HIV活性化合物を基に高活性化に必要な部位を同定し、高活性誘導体を得た。また、本化合物はウイルス粒子に存在する分子に影響を与えることで、感染性を消失させていることを明らかにした。CXCR4阻害剤に関する研究では、耐性HIVの性質に関する解析を基に阻害剤開発に有用な知見が得られた。以上の成果を多数の学術雑誌に報告し、関連特許を出願した。
• 臨床的観点からの成果: 本研究課題では、未治療標的に対する小分子化合物を基盤とした新規抗HIV化学療法剤の開発を目的としている。研究グループが同定した新規抗HIV化合物や新規CXCR4阻害剤に関して、実用化に向けた研究としてマウスやラットを用いた化合物毒性試験や薬物動態解析を行った。これらの化合物については現在、臨床応用へ向けた研究開発の途上ではあるが、これまでの生体を用いた解析から有用な成果を多数得ることができた。
• ガイドライン等の開発: 本研究課題ではガイドライン等の開発を目的としないため、該当なし。
• その他行政的観点からの成果: 本研究課題では、既存の抗HIV薬に抵抗性を示す薬剤耐性HIVの効果的な制御を可能とする新規抗HIV化学療法剤の開発を通して、抗HIV療法の高効率化を目指している。研究開発に供する化合物はいずれも極めて単純な化学構造からなる小分子であり、短工程での化学合成により大量供給が可能であることから、製造原価が低い有効な薬剤の提供に貢献する。また、得られた研究成果により、治療効果の改善を通じ、HIV感染症がコントロール可能な疾患との認識がより高まると期待される。
• その他のインパクト: 本研究課題に係る成果に関する特許を出願した。

発表件数

• 原著論文（和文）: 2件
• 原著論文（英文等）: 44件
• その他論文(和文): 0件
• その他論文(英文等): 3件
• 学会発表(国内学会): 17件
• 学会発表(国際学会等): 10件
• その他成果(特許の出願): 3件 ; 国内・国際を含む
• その他成果(特許の取得): 3件
• その他成果(施策への反映): 0件
• その他成果(普及・啓発活動): 0件

特許

• 特許の名称: 新規ケモカイン受容体拮抗剤
• 詳細情報: 分類: ; 特許番号: 特願2011-044035 ; 発明者名: 藤井信孝、大野浩章、大石真也、井ノ口恵利子、久保達彦、松岡雅雄、志村和也 ; 権利者名: 京都大学 ; 出願年月日: 20110301 ; 国内外の別: 国内

• 特許の名称: ベンゾイソチアゾロピリジン誘導体またはその塩、およびウイルス感染阻害剤ならびに医薬品
• 詳細情報: 分類: ; 特許番号: 特願2014-206613 ; 発明者名: 松岡雅雄、志村和也、藤井信孝、大野浩章、大石真也、水原司、岡崎志穂 ; 権利者名: 京都大学 ; 出願年月日: 20141007 ; 国内外の別: 国内

• 特許の名称: ピリミドベンゾチアジン-6-イミン誘導体またはその塩を含有するウイルス感染症の治療および/または予防のための薬剤
• 詳細情報: 分類: ; 特許番号: JP2012/061890 ; 発明者名: 前田英樹、加藤貴之、松岡雅雄、志村和也、藤井信孝、大野浩章、大石真也、水原司 ; 権利者名: 京都大学、富士フイルム ; 出願年月日: 20120509 ; 国内外の別: 国際（PCT）

• 特許の名称: ピリミドベンゾチアジン-6-イミン誘導体またはその塩を含有するウイルス感染症の治療および/または予防のための薬剤
• 詳細情報: 分類: ; 特許番号: 特開2012-250973 ; 発明者名: 前田英樹、加藤貴之、松岡雅雄、志村和也、藤井信孝、大野浩章、大石真也、水原司 ; 権利者名: 京都大学、富士フイルム ; 出願年月日: 20120307 ; 取得年月日: 20121220 ; 国内外の別: 国内

• 特許の名称: ピラゾール誘導体またはその塩ならびにそれらを含有する医薬組成物
• 詳細情報: 分類: ; 特許番号: 特開2014-214118 ; 発明者名: 前田英樹、加藤貴之、松岡雅雄、志村和也 ; 権利者名: 富士フイルム、京都大学 ; 出願年月日: 20130425 ; 取得年月日: 20141117 ; 国内外の別: 国内

• 特許の名称: 新規ケモカイン受容体拮抗剤
• 詳細情報: 分類: ; 特許番号: JP2012/055099 ; 発明者名: 藤井信孝、大野浩章、大石真也、井ノ口恵利子、久保達彦、松岡雅雄、志村和也 ; 権利者名: 京都大学 ; 出願年月日: 20120229 ; 取得年月日: 20120907 ; 国内外の別: 国際（PCT）

主な原著論文20編（論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限る）

• 原著論文1: Izumi K, Nakamura S, Nakano H et al.; Characterization of HIV-1 resistance to a fusion inhibitor, N36, derived from the gp41 amino terminal heptad repeat.; Antiviral Res. , 87 (2) , 179-186 (2010); doi: 10.1016/j.antiviral.2010.04.011.
• 原著論文2: Shimura K, Nameki D, Kajiwara K et al.; Resistance profiles of novel electrostatically constrained HIV-1 fusion inhibitors.; J. Biol. Chem. , 285 (50) , 39471-39480 (2010); doi: 10.1074/jbc.M110.145789.
• 原著論文3: Inokuchi E, Oishi S, Kubo T et al.; Potent CXCR4 antagonists containing amidine-type peptide bond isosteres.; ACS Med. Chem. Lett. , 2 (6) , 477-480 (2011); 10.1021/ml200047e. eCollection 2011.
• 原著論文4: Mizuhara T, Oishi S, Ohno H et al.; Concise synthesis and anti-HIV activity of pyrimido [1,2-c][1,3]-benzothiazin-6-imines and related tricyclic heterocycles.; Org. Biomol. Chem. , 10 (33) , 6792-6802 (2012); doi: 10.1039/c2ob25904d.
• 原著論文5: Mizuhara T, Oishi S, Ohno H et al.; Structure-activity relationship study of pyrimido[1,2-c][1,3]- benzothiazin-6-imine derivatives for potent anti-HIV agents. ; Bioorg. Med. Chem. , 20 (21) , 6434-6441 (2012); doi: 10.1016/j.bmc.2012.08.030.
• 原著論文6: Izumi K, Kawaji K, Miyamoto F et al.; Mechanism of resistance to S138A substituted enfuvirtide and its application to peptide design. ; Int. J. Biochem. Cell Biol. , 45 (4) , 908-915 (2013); doi: 10.1016/j.biocel.2013.01.015.
• 原著論文7: Mizuhara T, Oishi S, Ohno H et al.; Design and synthesis of biotin- or alkyne-conjugated photoaffinity probes for studying the target molecules of PD 404182.; Bioorg. Med. Chem. , 21 (7) , 2079-2087 (2013); doi: 10.1016/j.bmc.2013.01.016.
• 原著論文8: Oishi S, Watanabe K, Ito S et al.; Affinity selection and sequence-activity relationships of HIV-1 membrane fusion inhibitors directed at the drug-resistant variants.; Med. Chem. Commun. , 1 (4) , 276-281 (2010)
• 原著論文9: Izumi K, Watanabe K, Oishi S et al. ; Potent anti-HIV-1 activity of N-HR-derived peptides including a deep pocket-forming region without antagonistic effect on T-20.; Antivir. Chem. Chemother. , 22 (1) , 51-55 (2011); doi: 10.3851/IMP1836.
• 原著論文10: Kobayashi K, Oishi S, Hayashi R et al.; Structure-activity relationship study of a CXC chemokine receptor type 4 (CXCR4) antagonist FC131 using a series of alkene dipeptide isosteres.; J. Med. Chem. , 55 (6) , 2746-2757 (2012); doi: 10.1021/jm2016914.
• 原著論文11: Masuda R, Oishi S, Tanahara N et al.; Paradoxical downregulation of CXC chemokine receptor 4 induced by polyphemusin II-derived antagonists.; Bioconjug. Chem. , 23 (6) , 1259-1265 (2012)
• 原著論文12: Li X, Qian H, Miyamoto F et al.; A simple, rapid, and sensitive system for the evaluation of anti-viral drugs in rats.; Biochem. Biophys. Res. Commun. , 424 (2) , 257-261 (2012); doi: 10.1016/j.bbrc.2012.06.097.
• 原著論文13: Tanaka T, Narumi T, Ozaki T et al.; Azamacrocyclic-metal complexes as CXCR4 antagonists.; Chem Med Chem. , 6 (5) , 834-839 (2011); doi: 10.1002/cmdc.201000548.
• 原著論文14: Yanagita H, Urano E, Mastumoto K et al.; Structural and biochemical study on the inhibitory activity of derivatives of 5-nitro-furan-2-carboxylic acid for RNase H function of HIV-1 reverse transcriptase.; Bioorg Med Chem. , 19 (2) , 816-825 (2011); doi: 10.1016/j.bmc.2010.12.011.
• 原著論文15: Narumi T, Aikawa H, Tanaka T et al.; Low-molecular-weight CXCR4 ligands with variable spacers.; Front Microbiol. , 8 (1) , 118-124 (2012); doi: 10.1002/cmdc.201200390.
• 原著論文16: Miyauchi K, Urano E, Takeda S et al.; Toll-like receptor (TLR) 3 as a surrogate sensor of retroviral infection in human cells.; Biochem Biophys Res Commun. , 424 (3) , 519-523 (2012); doi: 10.1016/j.bbrc.2012.06.148.
• 原著論文17: Narumi T, Tanaka T, Hashimoto C et al.; Pharmacophore-based small molecule CXCR4 ligands.; Biorg Med Chem Lett. , 22 (12) , 4169-4172 (2012); doi: 10.1016/j.bmcl.2012.04.032.
• 原著論文18: Yanagita H, Fudo S, Urano E et al.; Structural modulation study of inhibitory compounds for RNase H activity of HIV-1 reverse transcriptase.; Chem Pharm Bull. , 60 (6) , 764-771 (2012)
• 原著論文19: Narumi T, Komoriya M, Hashimoto Cet al. ; Conjugation of cell-penetrating peptides leads to identification of anti-HIV peptides from matrix proteins.; Bioorg Med Chem. , 20 (4) , 1468-1474 (2012); doi: 10.1016/j.bmc.2011.12.055.
• 原著論文20: Takemura T, Kawamata M, Urabe M et al.; Cyclophilin A-dependent restriction to capsid N121K mutant human immunodeficiency virus type 1 in a broad range of cell lines.; J Virol. , 87 (7) , 4086-4090 (2013); doi: 10.1128/JVI.01319-12.

公開日・更新日

• 公開日: 2015-06-16
• 更新日: 2017-06-26

収支報告書

• 文献番号: 201210004Z